Meccanismi molecolari di carcinogenesi

Il cancro è causato da alterazioni a carico dei geni; distinguiamo  oncogeni, geni oncosoppressori e microRNA. Tali alterazioni sono di solito eventi somatici, sebbene mutazioni germinali possano predisporre un individuo allo sviluppo di tumori ereditari o famigliari. Una singola mutazione genica è raramente sufficiente affinché si sviluppi un tumore maligno, mentre numerosi studi hanno dimostrato che la trasformazione neoplastica è un processo multifasico che prevede numerose alterazioni sequenziali a carico di oncogeni, oncosoppressori e microRNA in una cellula carcinomatosa. D'altra parte già gli studi di epidemiologia in passato avevano fatto ipotizzare che più eventi moleari fossero necessari per determinare l'insorgenza iella maggior parte dei tumori. Infatti, generalmente i carcinomi sono abbastanza rari in età infantile e giovanile, mentre la loro frequenza aumenta in maniera logaritmica con l'avanzare dell'età ci sono specifiche mutazioni che possono rendere la cellula più aggressiva rispetto ad altre. Quindi la cellula può essere differente anche nel contesto di una stessa massa tumorale, può esprimere proteine cellulari superficiali, produrre altre proteine alterate, presentare alterazioni metaboliche e di comportamento. Ad esempio un clone produce un fattore di crescita e una altra cellula tumorale ne produce un altro; man mano che si riproducono saranno sempre più diverse dal clone di partenza. E' una cellula atipica, autonoma: non più sottoposta a meccanismi di controllo; sono autonome anche rispetto alle cellule del tessuto sano e alle cellule tumorali e perdono l'inibizione da contatto ad esempio e la proliferazione va avanti in maniera afinalistica. Afinalismo significa che la cellula tumorale si divide in modo afinalistico senza una modalità che comprende un fine, senza esigenze funzionali nel contesto di quell'organo, quindi cresce per sè stessa, per avere un vantaggio rispetto alle cellule sane e alle altre tumorali. Progressività: si replica in modo indefinito e tende sempre più ad acquisire le caratteristiche di malignità e invadere i tessuti distanti. Tale andamento può essere solamente spiegato come dovuto all'accumulo di più alterazioni geniche nell'ambito di una stessa cellula affinché essa possa andare incontro a trasformazione, e quindi dare origine ad una neoplasia.

Come dimostrato attraverso studi di citogenetica, i tumori sono generalmente costituiti da cloni differenti di cellule tumorali (eterogeneità clonale) derivanti dalla cellula trasformata iniziale a seguito di alterazioni geniche secondarie e terziarie. Nella popolazione di cellule tumorali sono inoltre incluse alcune cellule progenitrici neoplastiche (cancer stem cells), caratterizzate da uno spettro estremamente variabile di stadi differenziativi e di alterazioni geniche. Tutte queste popolazioni cellulari possono differire moltissimo per la loro sensibilità alla chemioterapia, radioterapia, ed altri trattamenti farmacologici, rendendo difficili le scelte terapeutiche e la gestione clinica della malattia. Pertanto, gli eventi molecolari che si verificano durante le tappe iniziali dello sviluppo tumorale rappresentano un aspetto importantissimo dal punto di vista clinico ed hanno un ruolo prioritario nella scelta della corretta terapia di una patologia neoplastica.
 

Gli oncogéni

Sono da considerarsi oncogeni tutti quei geni che in seguito ad eventi molecolari che ne determinano un guadagno di funzione ("gain-of-function") favoriscono la trasformazione e la progressione neoplastica. Si tratta di geni dominanti, ed è quindi sufficiente che l'alterazione avvenga in eterozigosi (a carico di un solo allele) affinché essa si traduca nel fenotipo trasformato. Gli oncogeni, quindi, rappresentano varianti alterate di geni cellulari altamente conservati durante l'evoluzione, chiamati proto-oncogeni, che codificano per proteine essenziali nei processi fisiologici di proliferazione, sopravvivenza e differenziamento cellulare (fattori di crescita, recettori di membrana, proteine coinvolte nella trasduzione del segnale e fattori di trascrizione). La conversione dei protooncogeni ad oncogeni, e la conseguente trasformazione cellulare, può avvenire attraverso due meccanismi principali:
a) alterazioni strutturali del prodotto proteico (alterazioni qualitative) o
b) alterazioni della regolazione della sua espressioni (alterazioni quantitative).
Le prime possono essere causate da:
a) mutazioni puntiformi a carico del proto-oncogeni; che alterano la funzionalità del prodotto proteici finale. Ad esempio, sono note numerose mutazioni puntiformi a carico del gene RET in pazienti affetti dalle sindromi endocrine neoplastiche multiple MEN 2, che colpiscono diverse ghiandole endocrine tra cui la tiroide;

b) riarrangiamenti cromosomici che troncano il protooncogene e determinano la formazione di geni di fusione codificanti per proteine chimeriche dotate di proprietà trasformanti. Un classico esempio di tali riarrangiamenti sono gli oncogeni chimerici RET/PTC nei carcinomi papilliferi della tiroide).
L'aumentata espressione dell'oncogene può invece essere causata da:
a) amplificazione genica a causa di errori durante il processo di replicazione del DNA; il gene c-ErbB2/ HER2, ad esempio, è frequentemente amplificato nei carcinomi della mammella.  In genere l'amplificazione genica si verifica nel corso della progressione tumorale;
b) alterazione del controllo trascrizionale del proto-oncogene. Nel linfoma di Burkitt, ad esempio, una traslocazione determina lo spostamento del proto-oncogene c-myc dal cromosoma 8 ad altri cromosomi. In seguito a tali riarrangiamenti cromosomici, c-myc si viene a trovare sotto il controllo trascrizionale dei promotori delle catene pesanti (t(8; 14)) oppure leggere (t(8;2) e t(8;22)) delle immunoglobuline. Come le traslocazioni, anche le inversioni cromosomiche possono essere responsabili dell'aumentata espressione di un proto-oncogene. In questo caso il gene viene trasferito da un sito all'altro dello stesso cromosoma a seguito di una rotazione di 181. T a tecnica del bandeggio cromosomico permette di evidenziare tale fenomeno per la presenza di bande in posizione invertita rispetto al cromosoma omologo. Tra le inversioni cromosomiche correlate ai tumori si ricordano l'inversione inv(16) (pl3;q22) nella leucemia mielomonocitica acuta, la inv(3)(q21 ;q26) nella leucemia mieloide acuta e la inv( 14)(ql 1 ;q32) nei linfomi a cellule T. Il genoma retrovirale è caratterizzato dalla presenza di geni peculiari che assicurano lo svolgimento delle operazioni essenziali per la sopravvivenza del virus stesso, chiamati gag, poi ed env, e codificanti rispettivamente per le proteine strutturali del nucleo-capside virale, per la trascrittasi inversa (necessaria per la replicazione del virus) e per le proteine del pericapside virale. Molti retrovirus presentano anche geni a funzione accessoria o regolatoria, particolarmente importanti, ad esempio, per il virus HIV.

La trascrittasi inversa è detta anche DNA-polimerasi RNA-dipendente e consente la conversione (retrotrascrizione) del genoma virale ad RNA in una molecola di DNA a doppio filamento; la sua scoperta, operata nel 1970 dal virologo statunitense Howard Temin e dal biologo molecolare David Baltimore, scardinò il dogma della genetica secondo cui l'informazione genetica fluisce dal DNA ali'RNA e non viceversa. I retrovirus, come tutti i virus, possono replicarsi soltanto all'interno di una cellula ospite e, in particolare, i retrovirus parassitano esclusivamente cellule di organismi eucarioti. Dopo aver preso contatto con la membrana plasmatica della cellula ospite, il retrovirus vi inocula il proprio materiale genetico e gli enzimi necessari per la replicazione virale. La trascrittasi inversa, quindi, dirige nel citoplasma della cellula ospite la sintesi di un filamento di DNA a partire dalla molecola di RNA virale, secondo un processo chiamato trascrizione inversa. Il filamento di DNA così formatosi (anche detto pro-virus) penetra nel nucleo e si integra nel genoma della cellula infettata. L'integrazione del prò-virus avviene grazie ad un enzima virale, l'integrasi, in grado di riconoscere alcune sequenze poste alle estremità del pro-virus, dette LTR (Long Terminal Redundancy-repeats). Le LTR. oltre ad essere fondamentali per il processo di integrazione retrovirale, svolgono anche un ruolo di regolazione dell'espressione dei geni del virus. Una volta integratosi, il retrovirus può rimanere silente anche per diversi anni, prima di scatenare patologie nell'organismo ospite. I retrovirus sono responsabili di infezioni in molti organismi viventi come uccelli e mammiferi, tra cui l'uomo. Alcuni ceppi, compresi nella sottofamiglia Oncovirinae, possono determinare l'insorgenza di forme di cancro e vengono perciò genericamente definiti oncovirus. I retrovirus oncògeni possono essere distinti in acuti e cronici. I retrovirus trasformanti acuti sono caratterizzati dalle seguenti proprietà:
a) sono capaci di trasformare cellule in coltura;
b) se iniettati in animali da esperimento inducono in tutti gli animali riceventi il virus diverse neoplasie (leucemie o sarcomi) dopo un breve periodo di latenza (1-2 settimane);
c) tranne il virus del Sarcoma di Rous, sono tutti difettivi per la replicazione in quanto mancano dei geni poi e env. Pertanto per la loro replicazione hanno bisogno della co-infezione da parte di un virus (detto "helper") che è generalmente rappresentato da un virus trasformante cronico che fornisce la trascrittasi inversa e le proteine del capside virale;
d) un numero considerevole di retrovirus conosciuti è stato ottenuto mediante passaggi seriali di retro-virus cronici in animali da esperimenti. Per esempio il virus del sarcoma di Harvey è stato originato mediante cicli di infezione del virus leucemico di Moloney in ratti da esperimento. Allo stesso modo, il virus del sarcoma di Kirsten deriva da passaggi seriali del virus leucemico di Kirsten.
Le caratteristiche principali dei retrovirus trasformanti cronici, invece, sono:
a) non sono capaci di trasformare cellule in coltura;
b) quando inoculati in esperimento inducono neoplasie di tipo cronico solo dopo un lungo periodo di latenza (3-18 mesi), e solo una percentuale degli animali svilupperà la malattia;
c) sono autonomi per la replicazione.
Molti oncogeni sono stati isolati a partire da retro-virus acuti. Questi virus, come detto, sono stati ottenuti da retrovirus trasformanti cronici in seguito a passaggi seriali in animali da esperimento. Tale procedura prevedeva l'infezione di una cavia con il retrovirus trasformante cronico: l'animale veniva quindi sacrificato e dai suoi organi veniva purificato nuovamente il retrovirus che era poi riinoculato in una nuova cavia.
 

Isolamento degli oncogeni mediante la tecnica della trasfezione


Un altro approccio sperimentale che ha consentito l'identificazione di nuovi oncogeni è stato quello basato sulla metodica della trasfezione. Grazie alla trasfezione, infatti, è possibile trasferire il DNA estratto da cellule tumorali umane in fibroblasti murini denominati NIH-3T3, una linea cellulare particolarmente suscettibile alla trasformazione neoplastica. Oltre ai normali geni cellulari, il DNA proveniente dalle cellule tumorali contiene anche gli oncogeni attivati responsabili del fenotipo trasformato; in seguito alla trasfezione, i fìbroblasti murini che ricevono gli oncogeni attivati formano delle strutture caratteristiche chiamate "foci" di trasformazione. Ovviamente la cellula che riceve l'oncogene viene trasfettata anche con diversi geni umani normali e che non hanno alcun ruolo nella formazione dei foci. Per questo motivo il DNA proveniente dai foci (contenente i geni murini delle NIH-3T3 ed alcuni geni di origine umana, tra i quali l'oncogene responsabile della trasformazione) viene isolato e nuovamente trasfettato in cellule NIH-3T3. Anche dopo questa trasfezione, le cellule riceventi l'oncogene formano foci di trasformazione. L'intera procedura viene ripetuta più volte affinché i foci di NIH-3T3 trasformate contengano solo ed esclusivamente il gene responsabile della trasformazione: ad ogni passaggio, infatti, il numero di geni umani privi di attività trasformante che vengono co-trasfettati con l'oncogene si riduce, fino ad arrivare a foci di trasformazione contenenti esclusivamente l'oncogene.
 

Isolamento degli oncogeni mediante analisi delle alterazioni cromosomiche specifiche di alcune neoplasie

Alcuni oncogeni sono stati isolati attraverso lo studio delle alterazioni cariotipiche caratteristiche di specifiche neoplasie. Questo è, ad esempio, il caso della traslocazione t(9;22): tale riarrangiamento cromosomico determina la formazione di un cromosoma derivativo (cromosoma Philadelphia) frequentemente riscontrato nei pazienti affetti da leucemia mieloide cronica. Analizzando la sequenza genomica corrispondente all'aberrazione cromosomica è stato identificato l'oncogene di fusione BCR-ABL, responsabile di questa patologia.
 

Isolamento degli oncogeni mediante sequenziamento di geni candidati in neoplasie umane

La conoscenza della sequenza di tutti i geni umani ha consentito di sviluppare progetti focalizzati al sequenziamento dell'intero genoma di cellule tumorali. Nuovi oncogeni sono già stati scoperti con questo approccio, come il gene BRAF (coinvolto in melanomi ma anche in carcinomi papilliferi della tiroide) e nuovi oncogeni coinvolti nella trasduzione del segnale nei carcinomi del colon.

I prodotti degli oncogeni

I prodotti degli oncogeni possono essere classificati in sei gruppi principali: fattori di trascrizione, proteine cromatiniche, fattori di crescita, recettori per fattori di crescita, trasduttori del segnale e regolatori dell'apoptosi.

Fattori di trascrizione

I fattori di trascrizione sono spesso membri di famiglie multigeniche che presentano domini strutturali comuni. Per espletare la loro funzione, molti fattori di trascrizione hanno bisogno di interagire con altre proteine. Ad esempio, il fattore di trascrizione Fos dimerizza con il fattore di trascrizione Jun per formare il complesso trascrizionale API, che incrementa l'espressione di numerosi geni che controllano la divisione cellulare e l'invasione. In alcuni tumori, l'attività del complesso API risulta de-regolata e la cellula trasformata acquisisce un vantaggio proliferativo aumentando la propria capacità di invadere il circolo sanguigno e dare metastasi. Spesso le traslocazioni cromosomiche attivano geni codificanti per fattori di trascrizione nelle neoplasie del sistema emopoietico, e ciò si verifica alle volte anche in alcuni tumori solidi, come per esempio nei carcinomi della prostata. Nei sarcomi sono piuttosto frequenti traslocazion: cromosomiche che generano geni di fusione che codificano per proteine chimeriche. Ad esempio, nel sarcoma di Ewing il gene EWS è frequentemente coinvolti in riarrangiamenti cromosomici che ne determinano la fusione con vari partner molecolari caratterizzati da una alterata capacità trascrizionale. La proteina EWS è. infatti, una molecola capace di legare il DNA che può stimolare in maniera aberrante la trascrizione genica in seguito alla fusione con domini eterologhi di legame al DNA. Nei carcinomi della prostata si verificano traslocazioni del gene TMPR552 che si fonde con i geni ERGI ed ETV. Tali geni sono membri della famiglia ETS, regolatori trascrizionali, che possono attivare o reprimere i geni coinvolti nella proliferazione cellulare, nel differenziamento e nell'apoptosi. La fusione di TMPR552 con i geni della famiglia ETS genera proteine di fusione che aumentano la velocità di crescita ed inibiscono l'apoptosi delle cellule della ghiandola prostatica, facilitando quindi la loro trasformazione in cellule neoplastiche.
Fattori architettonici della cromatina

Rimodellatori cromatinici

Modifiche del grado di compattezza della cromatina svolgono un ruolo critico nel controllo dell'espressione genica, nella replicazione, nella riparazione del DNA, e nella segregazione cromosomica. Due tipi di enzimi rimodellano la cromatina: enzimi ATP-dipendenti che modificano la posizione dei nucleosomi (le subunità degli istoni nella cromatina attorno alle quali il DNA è avvolto) ed enzimi che modificano le code N-terminali degli istoni. Le possibili combinazioni delle modifiche a carico degli istoni costituiscono un codice epigenetico che determina l'interazione tra nucleosomi e proteine associate alla cromatina. Queste interazioni, a loro volta, variano l'accessibilità della cromatina per i fattori trascrizionali.

Isolamento degli oncogeni mediante sequenziamento di geni candidati in neoplasie umane

La conoscenza della sequenza di tutti i geni umani ha consentito di sviluppare progetti focalizzati al sequenziamento dell'intero genoma di cellule tumorali. Nuovi oncogeni sono già stati scoperti con questo ap-proccio, come il gene BRAF (coinvolto in melanomi ma anche in carcinomi papilliferi della tiroide) e nuovi oncogeni coinvolti nella trasduzione del segnale nei carcinomi del colon.

I prodotti degli oncogeni

I prodotti degli oncogeni possono essere classificati in sei gruppi principali: fattori di trascrizione, proteine cromatiniche, fattori di crescita, recettori per fattori di crescita, trasduttori del segnale e regolatori dell'apoptosi.

Fattori di trascrizione

I fattori di trascrizione sono spesso membri di famiglie multigeniche che presentano domini strutturali comuni. Per espletare la loro funzione, molti fattori di trascrizione hanno bisogno di interagire con altre proteine. Ad esempio, il fattore di trascrizione Fos dimerizza con il fattore di trascrizione Jun per formare il complesso trascrizionale API, che incrementa l'espressione di numerosi geni che controllano la divisione cellulare e l'invasione. In alcuni tumori, l'attività del complesso API risulta deregolata e la cellula trasformata acquisisce un vantaggio proliferativo aumentando la propria capacità di invadere il circolo sanguigno e dare metastasi. Spesso le traslocazioni cromosomiche attivano geni codificanti per fattori di trascrizione nelle neoplasie del sistema emopoietico, e ciò si verifica alle volte anche in alcuni tumori solidi, come per esempio nei carcinomi della prostata. Nei sarcomi sono piuttosto frequenti traslocazion: cromosomiche che generano geni di fusione che codificano per proteine chimeriche. Ad esempio, nel sarcoma di Ewing il gene EWS è frequentemente coinvolti in riarrangiamenti cromosomici che ne determinano la fusione con vari partner molecolari caratterizzati da una alterata capacità trascrizionale. La proteina EWS è. infatti, una molecola capace di legare il DNA che può stimolare in maniera aberrante la trascrizione genica in seguito alla fusione con domini eterologhi di legame al DNA. Nei carcinomi della prostata si verificano traslocazioni del gene TMPR552 che si fonde con i geni ERGI ed ETV. Tali geni sono membri della famiglia ETS, regolatori trascrizionali, che possono attivare o reprimere i geni coinvolti nella proliferazione cellulare, nel differenziamento e nell'apoptosi. La fusione di TMPR552 con i geni della famiglia ETS genera proteine di fusione che aumentano la velocità di crescita ed inibiscono l'apoptosi delle cellule della ghiandola prostatica, facilitando quindi la loro trasformazione in cellule neoplastiche.
 

Fattori architettonici della cromatina - Rimodellatori cromatinici

Modifiche del grado di compattezza della cromatina svolgono un ruolo critico nel controllo dell'espressione genica, nella replicazione, nella riparazione del DNA, e nella segregazione cromosomica. Due tipi di enzimi rimodellano la cromatina: enzimi ATP-dipen-denti che modificano la posizione dei nucleosomi (le subunità degli istoni nella cromatina attorno alle quali il DNA è avvolto) ed enzimi che modificano le code N-terminali degli istoni. Le possibili combinazioni delle modifiche a carico degli istoni costituiscono un codice epigenetico che determina l'interazione tra nucleosomi e proteine associate alla cromatina. Queste interazioni, a loro volta, variano l'accessibilità della cromatina per i fattori trascrizionali. Nella leucemia linfocitica acuta e nella leucemia mieloide acuta, il gene ALL1 (denominato anche MLL) può andare incontro a fusione con più di 50 geni. La proteina ALL1 fa parte di un complesso multiproteico molto ampio che comprende fattori di trascrizione ed altre proteine coinvolte nella metilazione degli istoni e nelle modifiche a carico dell'RNA. L'intero complesso rimodella, acetila, deacetila, e metila i nucleosomi e gli istoni liberi. La fusione di ALL1 con uno dei 50 possibili geni partners comporta la formazione di geni di fusione responsabili della leucemia acuta linfoblastica e della leucemia mieloide acuta: le proteine chimeriche che ne derivano, infatti, deregolano diversi geni coinvolti nella trasformazione quali i fattori trascrizionali "homeo-box", il gene EPHA7 (che codifica per un recettore con attività tirosino-chinasi) ed alcuni microRNA come il miR-191.

Fattori di crescita

Anche un gene codificante per un fattore di crescita può contribuire alla trasformazione maligna. Uno dei primi fattori di crescita con attività oncogenica identificati è stato il Platelet-derived growth factor (PDGF). Il PDGF è un dimero composto da due catene polipeptidiche, dette alfa e beta, ed è rilasciato dalle piastrine durante la coagulazione. Il PDGF può indurre la proliferazione di diversi tipi cellulari e stimolare i fìbroblasti a partecipare alla rimarginazione delle ferite. L'oncogene sis, derivante dal Simian sarcoma virus, è strutturalmente simile al gene che codifica per la catena beta del PDGF. L'iperespressione del PDGF induce la trasformazione in vitro dei fìbroblasti che esprimono i recettori per il PDGF mentre non mostra alcun effetto sui fìbroblasti che mancano di tali recettori. Il meccanismo autocrino che viene innescato determina un incremento dei livelli di PDGF e del suo recettore, causando una crescita cellulare incontrollata. Anticorpi diretti contro il PDGF-beta o il suo recettore, o le piccole molecole in grado di bloccarne l'attività riescono ad inibire la crescita dei fìbroblasti trasformati. Le glicoproteine secrete della famiglia di WNT inibiscono la fosforilazione e la degradazione della beta catenina, un fattore coinvolto nell'adesione cellula-cellula e nell'attivazione di numerose vie di trasduzione del segnale che modulano la motilità cellulare. La proteina APC controlla negativamente l'attività di beta catenina determinandone la degradazione: nella poliposi adenomatosa famigliare, mutazioni inattivanti di APC bloccano la degradazione di beta catenina inibendo la sua fosforilazione. Conseguentemente, la beta catenina libera nel citoplasma trasloca al nucleo, dove attiva l'espressione di geni coinvolti nella proliferazione ed invasione cellulare.

Recettori per fattori di crescita

I recettori per fattori di crescita sono alterati in molte neoplasie. In molti tumori, ad esempio, si verifica la perdita del dominio di interazione con il ligando del recettore tirosino chinasi del fattore di crescita epidermico (Epidermal growth factor receptor, EGFR), che determina una attivazione recettoriale costitutiva anche in assenza di legame al ligando. Tali mutazioni si riscontrano nei carcinomi del polmone, della mammella e nei tumori gastrointestinali di tipo stromale. La ricerca farmacologica ha sviluppato due classi di agenti clinicamente attivi in grado di contrastare l'attività dell'EGFR: un anticorpo monoclonale diretto contro il dominio extracellulare del recettore (cetuximab) ed alcuni inibitori che competono con l'attività tirosino chinasi del recettore (erlotinib e gefìtinib). II vascular endothelial growth factor (VEGF) regola la trascrizione genica in risposta allo stato di ipossia. L'attività del VEGF è modulata da tre tirosino chinasi di tipo recettoriale: VEGFR1 (FLT1), VEGFR2 (FLK1-KDR) e VEGFR3 (FLT4). Il VEGF stimola l'angioge-nesi in diverse neoplasie, ed è per questo che sono stati realizzati diversi inibitori di VEGF e/o dei suoi recettori: il Bevacizumab, ad esempio, è un anticorpo monoclonale diretto contro VEGF, mentre il SU5412, una piccola molecola, lega ed inibisce la subunità enzimatica dei recettori VEGFR1 e VEGFR2 nonché le chinasi del recettore di PDGF e KIT.
 

Trasduttori del segnale

Il legame di un recettore tirosino chinasi al proprio ligando causa una riorganizzazione della struttura recettoriale e l'autofosforilazione delle tirosine localizzate nella porzione intracellulare del recettore. L'autofosforilazione facilita l'attività del recettore o ne promuove l'interazione con domini di proteine citoplasmatiche (es. SH2-src homolgy domain 2) che sono effettori e regolatori del "signaling" intracellulare. Nell'uomo ci sono circa 120 domini SRC homology 2 in 100 differenti proteine che mediano la risposta a segnali iniziati da tirosine fosforilate. Alcune di queste proteine sono dotate di una propria attività enzimatica, mentre altre proteine mediano l'associazione dei recettori attivati con altre proteine-bersaglio a valle.
Molti oncogeni codificano per membri di vie di trasduzione del segnale. Essi possono essere divisi in due grosse classi: protein-chinasi di tipo non recettoriale e proteine leganti guanosina trifosfata. Le protein-chinasi di tipo non recettoriale sono di due tipi: tirosino chinasi (ABL, LCK, e SRC) e serin-treonin-chinasi (AKT, RAF1, MOS, e PIMI). Le proteine coinvolte nella trasduzione del segnale diventano oncogeniche se vanno incontro a mutazioni attivanti. Un esempio importante è rappresentato da PI3K e da alcuni dei suoi bersagli a valle, quali AKT e SGK, e che rivestono un ruolo critico nella trasduzione del segnale di vari recettori tirosino chinasi, e possono essere mutate in diversi tipi di cancro.
 

Regolatori dell'apoptosi

Il gene BCL2, che è coinvolto nell'insorgenza della maggior parte dei linfomi di tipo follicolare ed alcuni linfomi diffusi a cellule B, codifica per una proteina citoplasmatica che si localizza nei mitocondri ed incrementa la sopravvivenza cellulare mediante l'inibizione dell'apopoptosi. BCL2 è importante anche nelle leucemie linfocitiche croniche e nei carcinomi del polmone. Due vie principali portano all'apoptosi: lo "stress pathway" ed il "death receptor pathway". Il primo pathway è innescato dalle proteine che contengono il dominio BCL2 homology 3 (BH3). Grazie a tale dominio, le proteine di questa famiglia interagiscono con BCL2 e BCL-XL, e inibiscono la loro attività anti-apoptotica, favorendo il rilascio del citocromo-c e l'attivazione delle caspasi, innescando così la cascata apoptotica. Al momento sono in corso di sviluppo farmaci (peptidi oppure piccole molecole che possano mediare il legame di tali proteine) che possano mimare il dominio BH3 e che siano capaci di legare BCL-XL oppure BCL2. Questo approccio ha attratto considerevole attenzione dal momento che molti tumori iper-esprimono BCL2 oppure le proteine correlate. Il "death-receptor pathway" è attivato dal legame di TRAIL e del "tumor necrosis factor alfa" al loro corrispondente recettore sulla superficie cellulare. L'attivazione dei "death receptors" attiva le caspasi che causano poi la morte cellulare.
 

I geni della famiglia ras

La famiglia ras comprende tre membri: c-ras-Ha, c-ras-Ki ed N-ras. I primi due sono stati isolati per la prima volta dal virus del sarcoma murino di Harvey e di Kirsten, rispettivamente, mentre N-ras è stato isolato mediante la tecnica della trasfezione a partire da cellule di neuroblastoma umano. I geni della famiglia ras codificano per proteine ad alta omologia di 188-189 aminoacidi, con un peso molecolare di circa 21 KDa. Le proteine ras sono delle proteine G, e più specificamente delle piccole GTPasi, cioè proteine capaci di idrolizzare il GTP a GDP e gruppo fosfato. Tali GTPasi possono trovarsi in due possibili conformazioni, legante il GTP (ras-GTP), ed una inattiva complessata con il GDP (ras-GDP). Le piccole proteine GTPasiche aderiscono al late interno della membrana cellulare mediante residui di cisterna localizzati a livello della loro porzione carbossi-terminale che sono premiati e palmitoilati a livello post-traduzionale. All'estremità carbossi-terminale delle proteine ras, infatti, è situato un dominio peptidico. detto CAAX box (costituito da una cisteina, due am-minoacidi alifatici ed un amminoacido qualsiasi), fondamentale per l'aggancio in membrana di tali proteine. In primo luogo, alla cisteina della CAAX box viene aggiunto un residuo idrofobico di geranil-geranil fosfato, che consente il legame della proteina alla membrana, a livello del reticolo endoplasmatico. Quindi il tripeptide AAX viene staccato da una endoproteasi. ed il gruppo carbossilico della cisteina viene mediato da una metil-trasferasi. La proteina ras così processata viene definitivamente agganciata alla membrana. Nel caso di c-ras-Ha, si verifica anche una ulteriore modifica, la palmoitoilazione, a livello di una cisteina localizzata alcuni residui più a monte della CAAX box. Per quanto riguarda c-ras-Ki, esso interagisce elettrostaticamente con la membrana grazie ad un lungo dominio peptidico costituito da amminoacidi carichi positivamente. Le proteine della famiglia ras hanno un ruolo cruciale nella fisiologia cellulare in quanto fungono da mediatori tra i recettori per fattori di crescita e gli effettori mitogenici a valle coinvolti nella proliferazione o nel differenziamento cellulare. A seguito della loro attivazione, infatti, numerosi recettori tirosino chinasi interagiscono con le proteine della famiglia ras e ne determinano il passaggio dalla loro conformazione inattiva, quando legano il guanosindifosfato (GDP), a quella attiva, in grado cioè di interagire con le molecole bersaglio, quando legano il guanosintrifosfato (GTP). L'attività GTPasica delle proteine ras è però strettamente regolata anche da altre proteine, delle quali alcune esercitano un'azione attivante ed altre, al contrario, un'azione inibente.

In sostanza, ne deriva che:

 Nella sua forma inattiva, Ras lega il GDP. Stimoli extracellulari (ad esempio attivazione di recettori tirosino-chinasi) e l'attività delle GEF (GTP exchanging factors) stimolano il rilascio del GDP ed il legame al GTP. Ras legato al GTP passa nella propria conformazione attiva, in grado cioè di trasdurre segnali a valle. Mutazioni oncogeniche di Ras o delle proteine necessarie per la sua inattivazione (che si verifica a seguito dell'idrolisi del GTP a GDP) determinano una attivazione costitutiva dei segnali proliferativi indotti da Ras (vedi figura)
Le principali proteine che regolano la funzione delle proteine ras sono:
a) GAP (GTPase Activating Protein): Favorisce l'idrolisi del GTP mantenendo le proteine ras allo stato inattivo e facilitando il distacco dalla molecola bersaglio. E inattivato in conseguenza della trasduzione del segnale innescata da alcuni fattori di crescita (ad es. EGF, PDGF, FGF), e la sua inattivazione determina un incremento della attività della proteina ras. Lo stesso effetto si ha per deficiente sintesi della proteina GAP:
b) GIP (GTPase Inhibitory Protein): Si tratta di una famiglia di proteine aventi in comune la proprietà di inibire l'attività GTPasica delle proteine ras;
c) GNRF (Guanine Nucleotide Releasing Factor): Incrementa l'attività delle proteine ras facilitando il distacco del GDP e favorendo l'associazione col GTP:
d) GDF (GDP Dissociation Factor): Famiglia di proteine che mantengono le proteine ras allo stato inattivo impedendo lo scambio GDP/GTP
 

Mutazioni di ras nei tumori umani

Le mutazioni dei geni della famiglia ras nei tumori umani riguardano i codoni 12 e 13 nella regione di legame al fosfato (p-loop o phosphate binding loop) ed il residuo 61 nella regione ad attività catalitica. Le mutazioni del residuo 12 rendono il dominio GTPasico di ras insensibile all'inattivazione da parte di GAP (che favorisce l'idrolisi del GTP a GDP), quindi, a causa della propria debole attività enzimatica, ras rimane nella sua forma attiva legato a GTP. Nel caso delle mutazioni del codone 61, invece, si verifica un'alterazione del sito catalitico che inibisce l'attività GTPasica della proteina, e quindi, anche in questo caso, la proteina Ras rimane costitutivamente nella sua forma attiva. Numerosi studi hanno dimostrato che le mutazioni dei geni ras rappresentano un evento iniziale nel processo di carcinogenesi. I primi studi hanno utilizzato il modello della carcinogenesi cutanea di Berenblum. In questo modello il trattamento della cute del topo con un mutageno (il dimetibenzantracene, un composto appartenente alla famiglia degli idrocarburi policiclici) seguito dal trattamento con un co-carcino-geno (estere del forbolo) induce la formazione di tumori benigni della cute denominati papillomi, che poi evolvono in carcinomi. E stato dimostrato che mutazioni del gene ras erano presenti sia a livello di papillomi che di carcinomi, indicando che le mutazioni di ras rappresentano un evento precoce del processo di tumorigenesi. L'oncogene B-RAF
Il primo gene della famiglia raf è stato inizialmente isolato a partire da un retrovirus murino contenente 1 ' oncogene v-raf. Da allora, nell'uomo sono stati identificati tre geni codificanti per le proteine della famiglia RAF: A-RAF, B-RAF e C-RAF (anche noto come Raf-1). Si tratta di proteine con attività serin-treonin chinasi a localizzazione citoplasmatica.
Le proteine codificate dai geni RAF sono delle serin-treonin chinasi, e fanno parte di una via di trasduzione del segnale altamente conservata a valle delle proteine ras, la cui attivazione, come detto in precedenza, dipende da fattori di crescita, ormoni e citochine. Le proteine RAF si legano a RAS solo quando ras è legato al GTR ma non quando è legato al GDR
RAS stimola l'attivazione di RAF, che attiva a sua volta una seconda proteina denominata MEK, che a sua volta attiva una terza proteina denominata ERK. ERK modula l'espressione genica, i riarrangiamenti del cito-scheletro, ed il metabolismo, coordinando le risposte a segnali extracellulari e regolando la proliferazione cellulare, la senescenza e l'apoptosi.
B-RAF presenta la più alta frequenza di mutazioni nei melanomi (60-70%), nei carcinomi papillari della tiroide (36-53%), carcinomi colorettali (5-22%), carcinomi sierosi dell'ovaio (30), ed in bassa percentuale anche in una larga varietà di altre neoplasie. Mutazioni di B-RAF si riscontrano in un'alta percentuale di nevi (60-70%), lesioni benigne cutanee a carico del mela-nociti, nelle quali si suppone che le cellule siano sene-scenti, e sono state riscontrate anche nei polipi colon-rettali.
Si ritiene quindi che le mutazioni di B-RAF siano un evento precoce nel processo di carcinogenesi, e che non siano sufficienti da sole a generare una neoplasia.
La proteina B-RAF è costituita da tre domini proteici principali:
a) CR-1, corrispondente al sito di legame per RAS;
b) CR-2, che presenta una serie di siti di fosforilazione:
c) CR-3, il domino ad attività enzimatica serin-treonin chinasi.
Più di 40 diverse mutazioni "missense" sono state individuate e riguardano 23 differenti codoni. La maggior parte delle mutazioni sono rare, e riguardano solo lo 0,1-2% di tutti i casi. Tuttavia la mutazione che riguarda il codone 600 con una trasversione da timi-dina ad adenosina e che determina la conversione di una valina (V600) in un residuo di acido glutammico risulta di gran lunga la più frequente ed è responsabile del 90% delle mutazioni in B-RAF nei melanomi e nei carcinomi papillari della tiroide. V600 può essere mutata anche ad altri residui aminoacidici, ma con una frequenza di gran lunga minore.
 

La famiglia degli oncogeni c-myc

Il gene umano c-myc è l'omologo dell'oncogene v-myc, identificato per la prima volta in un retrovirus aviario, il virus MC-29 della mielocitomatosi, che induce leucemia mieloide, sarcomi, carcinomi epatici e renali. I prodotti dei vari geni myc sono evidenziabili nelle cellule di numerosi tessuti in seguito a stimolazione mitogenica, lasciando quindi ipotizzare che essi agiscano in vie di trasduzione di segnali comuni a molti tipi cellulari. Il gene c-myc è stato generalmente associato a promozione della proliferazione cellulare, desensibilizzazione a stimoli inibitori della crescita, blocco del differenziamento, immortalizzazione cellulare, trasformazione cellulare e sensibilizzazione a segnali stimolanti l'apoptosi. Le proteine MYC costituiscono una famiglia di fattori di trascrizione che include, oltre al prodotto del gene c-myc, anche le proteine N-myc ed L-myc, rispettivamente coinvolte nella genesi del neuroblastoma e del microcitoma. I membri della famiglia Myc sono caratterizzati dal dominio bHLH/LZ (basic Helix-Loop-Helix/ Leucin Zipper): grazie al bHLH, Myc è in grado di legare il DNA, mentre il dominio LZ è necessario per la dimerizzazione di Myc con il suo partner Max, un altro fattore trascrizionale che presenta un dominio bHLH. Diversi signali mitogenici quali Wnt, Shh, ed EGF in seguito all'attivazione a cascata delle chinasi MAPK/ERK) possono indurre l'espressione di Myc. A sua volta, Myc regola positivamente l'espressione di un gran numero di geni (quali, ad esempio, alcune cicline) attraverso il legame a sequenze consenso (Enhancer box sequences-E boxes) ed il reclutamento delle istone acetiltransferasi (HATs). Allo stesso tempo, Myc può interagire con numerosi altri fattori trascrizionali e può regolare negativamente l'espressione di geni coinvolti nella proliferazione cellulare, come p21. La proteina c-myc, quindi, esercita effetti contrastanti sull'espressione genica, ed una sua iper-espressione può determinare una vasta gamma di effetti biologici, dalla stimolazione e progressione del ciclo cellulare alla induzione della morte cellulare programmata. Questo strano comportamento è stato chiarito in seguito alla scoperta che, mediante "splicing alternativo", possono originare due distinte proteine Myc, definite c-Mycl e c-Myc2, che sembrano avere rispettivamente un effetto negativo o positivo sulla proliferazione cellulare. La complessità del fenomeno non si limita a questo: infatti, per essere attiva, la proteina myc ha bisogno di complessarsi con la proteina max, formando in questo modo eterodimeri Myc-Max che attivano la trascrizione genica, al contrario degli omodimeri Max-Max ad attività inibitoria. Myc risulta iperespresso in numerose neoplasie maligne, quali leucemie, carcinomi del colon, dell'ovaio, del polmone e così via. Le alterazioni del gene myc hanno un ruolo determinante nello sviluppo del linfoma di Burkitt, una neoplasia indotta dal virus di Epstein-Barr e che si presenta in forma endemica in alcune regioni dell'Africa, dove colpisce preferenzialmente i bambini, ed in forma sporadica in altre regioni. In questa neoplasia il proto-oncogene c-myc va incontro a tre possibili traslocazioni, la t(8;14) (q24;q32), la più frequente (90% dei casi) e considerata generalmente come traslocazione tipica, e le traslocazioni t(8;2) (q24;ql2) e t(8;22) (q24;qll), comunemente descritte come varianti. In seguito a tali riarrangiamenti, il protooncogene c-myc, localizzato a livello del braccio lungo del cromosoma 8, viene a collocarsi rispettivamente in prossimità di sequenze promotrici (promoters) o facilitanti (enhancers) dei geni che nel cromosoma 14 codificano per le catene pesanti delle immunoglobuline, nel cromosoma 2 per le catene leggere di tipo k e nel cromosoma 22 per quelle leggere di tipo A. Con questa traslocazione, che può essere anche reciproca, c-myc viene a trovarsi sotto il controllo trascrizionale di elementi genomici che nei linfociti B sono perennemente attivati, con la conseguenza che la sua espressione risulta significativamente incrementata. In alcune regioni dell'Africa centrale, la malaria ed il virus di Epstein-Barr inducono una stimolazione immunitaria con iperfunzione delle regioni di regolazione dei geni che codificano per le immunoglobuline nei linfociti B.
 

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