La coltivazione dei microrganismi in laboratorio, ed in particolare dei batteri, richiede terreni di coltura che riproducano condizioni nutritizie e ambientali adatte ad ogni specie che si vuole studiare. I terreni di coltura possono essere definiti come mezzi artificiali sterili contenenti la giusta concentrazione di tutti gli elementi nutritivi per la crescita batterica, oltre ad un adeguato grado di umidita' ed un corretto pH. Questi mezzi devono quindi poter permettere lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo. Caratteristiche del terreno di coltura sono:
- concentrazione adatta di sostanze nutritive per la crescita batterica
- adeguato grado di umidita'
- reazione (pH) adatta
- sterilita' e protezione da qualsiasi inquinamento e, per le specie batteriche
anaerobiche, anche la protezione dall'ambiente ossigenato.
I terreni contengono:
- Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida
od enzimatica) delle proteine (caseina, soja, ecc.);
- NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le necessita' osmotiche
richieste, in vivo, da alcuni microrganismi parassiti
- Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, sono aggiunti per scopi
specifici in terreni particolari
- Estratti di lievito, carne d'organo: forniscono fattori di
crescita e sali inorganici
Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina
vitamine. Necessari per la crescita di batteri piu' "esigenti" dal punto di vista
nutrizionale
- Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno
definito (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide)
- Indicatori: le sostanze coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso
fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.) permettono di seguire il metabolismo
fermentativo del batterio in esame, determinando il viraggio di colore del
terreno a valori critici di pH
I terreni di coltura per i batteri possono essere suddivisi in base a differenti criteri:
In base allo stato fisico: terreni liquidi e terreni solidi
In base alla costituzione chimica: terreni minimi e terreni complessi; terreni
sintetici (o semplici) e semisintetici
In base alla funzione: terreni di arricchimento, terreni selettivi e terreni
differenziali.
Sono di consistenza liquida; appaiono limpidi, se sterili; evidenziano la crescita batterica con un intorbidamento del terreno. L'intorbidamento puo' avere diverso aspetto a seconda della specie batterica interessata: puo' essere diffuso in tutto il recipiente di coltura o limitato agli strati superficiali o addirittura ad una pellicola alla superficie del liquido. I terreni liquidi sono adatti a microrganismi anaerobi o aerobi facoltativi e agli aerobi obbligati, sebbene questi richiedano che il substrato sia in recipienti poco profondi, che sia agitato o che sia fornito di aria.
I substrati liquidi possono essere resi solidi o semisolidi per
aggiunta di:
gelatina: e' il gelificante piu' antico, solidifica a basse temperature (22oC) e
viene liquefatto da microrganismi proteolitici.
agar: e' un polisaccaride acido estratto da alghe rosse del genere Gelidium;
disciolto a caldo (a temperatura al di sopra di 80oC) in un liquido,
nella proporzione dell'12%, ne provoca, durante il successivo raffreddamento (45-50oC), la gelificazione in una massa di consistenza sufficiente per
gli scopi cui i terreni di coltura solidi devono rispondere.
gellano: e' un polisaccaride prodotto da microrganismi che puo' essere prodotto in
forma piu' stand rispetto all'agar.
Sono adatti a microrganismi aerobi coltivati in superficie, anaerobi coltivati
in profondita' o per infissione. La crescita batterica si manifesta sotto forma
di colonie isolate (Figura 19.2) o formando una patina. Permettono
l'l'isolamento in coltura pura e permettono di e morfologia delle colonie.
L'acqua viene in genere aggiunta al terrene qua deionizzata.
L.'agar e' l'ingrediente piu' utilizzato per rendere solido un
terreno in quanto ha le seguenti proprieta': non e' metabolizzato dai batteri e
non manifesta alcuna tossicita';
e' costituito da un reticolo tridimensionale le cui maglie permettono una libera
diffusione delle sostanze nutritive disciolte e la replicazione batterica, ma
non consentono ai microrganismi di spostarsi e migrare da un punto all'altro
del terreno;
forma una massa solida con umidita' ottimale; possiede un punto di fusione tra i 97 e 100oC; raffreddandosi, solidifica tra
i 42 e 47oC;
non e' alterato dalle alte temperature di sterilizzazione.
La composizione chimica dei vari terreni di coltura e' diversa in relazione alle necessita' nutrizionali del microrganismo che si vuole coltivare. Nei terreni minimi gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono aggiunti come sali inorganici in concentrazione nota; in questi terreni possono moltiplicarsi solo i batteri chemioautotrofi. Nella routine diagnostica si utilizzano i terreni complessi: substrati contenenti varie sostanze naturali chimicamente non ben definite (fonti di azoto organico, come peptoni; fonti di fattori di crescita, come estratto di lievito, estratto di carne; liquidi organici, come sangue, siero) i quali derivano dai tradizionali "brodi" batteriologici con il vantaggio di un minor costo di allestimento e di una maggiore rispondenza, in genere, alle necessita' dei batteri patogeni al momento dell'isolamento in coltura. Per la maggior parte dei batteri e' possibile allestire terreni sintetici, la cui composizione e' perfettamente nota. Essi sono costituiti, oltre che da acqua, da composti organici ed inorganici addizionati in concentrazioni note, quali fonti sia di C, N, S, P che di aminoacidi, basi azotate e vitamine. Sono adatti a microrganismi con esigenze nutrizionali semplici ma anche a microrganismi con esigenze nutrizionali elevate, quando queste ultime siano perfettamente note. I terreni semisintetici contengono sia elementi propri dei terreni semplici che componenti complessi. I terreni di base, usati in batteriologia per coltivare i batteri senza particolari esigenze nutritive, sono costituiti dal brodo normale e dall'agar. Il brodo normale e' costituito da una soluzione allo 0,5% di peptoni arricchita dello 0,3% di estratto di carne, il tutto portato all'isotonicita' mediante aggiunta di NaCl e tamponato intorno a pH 7,0 con tampone fosfato; per ottenere il terreno solido, il brodo verra' addizionato dell'1,5% di agar. Ai terreni di base possono essere aggiunti, a seconda delle esigenze nutrizionali del batterio, vari altri substrati come sangue, estratto di lievito, siero ecc.
I Terreni si definiscono di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI) se la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai piu' breve rispetto ad altre specie microbiche. Si definiscono, invece, Terreni SELETTIVI se contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, etrimide, cristalvioletto) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Utilizzati per l'isolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati. Infine i Terreni DIFFERENZIALI sono cosi' definiti se contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Usati per la identificazione di specifici microrganismi.
I substrati possono essere resi selettivi, dunque, per aggiunta di:
- antibiotici (la cicloeximide inibisce gli eucarioti, il cloramfenicolo
e'
efficace contro un'ampia varieta' di microrganismi);
- quantita' elevate di sali (ad es. NaCl);
- altre sostanze inorganiche od organiche (sodio azide, cristalvioletto,
ecc.).
Gli emulsionanti possono essere aggiunti per favorire l'assimilazione di
substrati complessi (ad es. Tween 80 permeabilizza le membrane). Gli indicatori
acidobase (tornasole, porpora di bromocresolo, ecc.) o redox blu di metilene,
resazurina) sono usati in substrati differenziali.
Molti microrganismi modificano sostanzialmente il pH del substrato durante la
crescita. Per controllare il pH e' possibile aggiungere tamponi insolubili
(carbonato di calcio, citrato di calcio, ecc.) o solubili (fosfati, citrati,
malati, acetati ecc.). La scelta del tampone dipende dal valore al quale si
desidera controllare il pH. Il pH puo' essere in alcuni casi controllato per
aggiunta automatica di acidi o basi (fermentatori
I terreni a composizione esattamente definita (terreni sintetici) possono
essere suddivisi in terreni normali, che permettono la crescita di molte specie
microbiche, terreni ricchiarricchiti e terreni speciali suddivisi in base agli
elementi che possono essere aggiunti al terreno per migliorare la selezione e
la differenziazione (in modo particolare quella dei batteri patogeni) in:
terreni selettivi adatti alla moltiplicazione di una determinata specie batterica o di un numero ristretto di
microrganismi. Esplicano una pressione selettiva per la
crescita batterica grazie all'aggiunta di sostanze batteriostatiche (verde di malachite, sali biliari, elevate concentrazioni di NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto, valori di pH
acidi, valori di pH alcalini, tellurito di potassio, antibiotici). Questi
terreni vengono utilizzati per isolare specifici microrganismi da campioni polimicrobici e le sostanze presenti a concentrazioni note inibiscono o
rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche contaminanti, ma non di
altre. Il Mannitol Salt Agar contiene il 7,5% di NaCl che inibisce la maggior
parte dei batteri Gram negativi; e' un terreno selettivo per l'isolamento degli alofili, in particolare per gli stafilococchi. L'agar MacConkey contiene sali
biliari e cristalvioletto che inibiscono la crescita dei batteri Gram positivi;
e' un terreno selettivo per l'isolamento degli enterobatteri. terreni di
arricchimento sono anch'essi terreni selettivi liquidi. La presenza di
particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favorisce la crescita
di batteri piu' esigenti dal punto di vista nutrizionale, mentre allunga la fase
di latenza delle specie competitive. Il Brodo Selenite e' un esempio di brodo di
arricchimento per salmonella.
- terreni differenziali contengono particolari indicatori che consentono di
distinguere tra loro specie batteriche differenti, sfruttando caratteristiche
macroscopiche delle colonie. Questi terreni permettono la crescita di specie
diverse di microrganismi rendendo possibile alle colonie di un dato batterio di
svilupparsi assumendo un aspetto tale da essere facilmente distinguibili, per
esempio in base alla colorazione.
- Cetrimide agar: terreno selettivo per l'isolamento e l'identificazione
presuntiva di Pseudomonas aeruginosa. Il magnesio cloruro e il potassio solfato
servono per stimolare la produzione di pigmento. La cetrimide inibisce la
crescita di gran parte dei microrganismi.
- Columbia Blood agar base: terreno di uso generale e base per terreni al sangue (Staphylococcus
aureus, streptococchi emolitici) e selettivi (cocchi Gram positivi,
Helicobacterpylori, Gardnerella) .
- Hektoen Enteric agar: terreno differenziale e selettivo per l'isolamento di
Salmonella spp. e Shigella spp. da campioni enterici. I sali biliari inibiscono
la crescita della normale popolazione microbica Gram positiva. La presenza di
tiosolfato e sali di ferro e' utile per evidenziare 1 di H2S (Salmonella).
- MacConkey agar: terreno selettivo e differenziale utilizzato per l'isolamento
degli enterobatteri (Shigella) e, in particolare, dei coliformi (Escherichia
Coli, Klebsiella). La presenza di cristalvioletto e dei sali biliari inibisce la
crescita di Gram positivi. La presenza di lattosio evidenzia la capacita'
fermentante: le colonie fermentanti il lattosio appariranno rosa acceso ( quelle non fermentanti incolori).
- Urea broth base (terreno di Christensen): terreno utilizzato per evidenziare
attivita' ureasica delle Enterobacteriaceae mediante viraggio di un indicatore
di pH (rosso fenolo).
- Mannitol Salt agar: terreno selettivo e differenziale per l'isolamento e
l'identificazione presuntiva degli stafilococchi in campioni clinici. Azione
selettiva dell'elevata concentrazione (7,5%) di NaCl. Le colonie di Staph.
aureus fermentano il mannitolo, contenuto nel terreno, e sono circondate da una
zona gialla. La fermentazione del mannitolo, da parte dei batteri, provoca
un'acidificazione del terreno (produzione ioni H30+), con conseguente viraggio
del colore da rosso a giallo. Gli stafilococchi
mannitolonegativi formano colonie di colore rosso porpora. La
fermentazione del mannitolo e' un test orientativo che dovra' essere completato
dalla ricerca della coagulasi.
-MuellerHinton agar: impiegato per l'esecuzione dei test di antibioticosensibilita'.
-Saboraud Dextrose agar: terreno acido (pH 5,6) indicato per l'isolamento di
muffe e lieviti.
-SalmonellaShigella agar (agar SS): terreno selettivo e differenziale per
l'isolamento di Salmonella e Shigella dalle feci e da campioni di altra natura.
Un terreno di coltura deve rispondere non solo alle necessita' nutrizionali, ma
anche ai requisiti fisicochimici del metabolismo di un dato batterio. Affinche'
la coltivazione porti alla crescita del batterio, e' necessario che anche
l'ambiente in cui il terreno viene mantenuto sia idoneo alle particolari
esigenze del batterio in questione.
Il terreno dovra' essere incubato alla temperatura ottimale per il
metabolismo batterico. La maggior parte dei batteri (compresi i patogeni per
l'uomo) sono mesofili e crescono meglio tra 30 e 37oC, con optimum di
temperatura intorno ai 36-37oC. Le forme psicrofile crescono bene a bassa
temperatura, tra 15 e 20oC, le termofile tra 50 e 60oC (Figura 19.9). Il
limite superiore dell'intervallo di temperatura tollerato da una determinata
specie batterica e' correlato con la stabilita' termica generale delle proteine
di quella specie. Tutti i microrganismi presentano una risposta allo shock
termico simile a quella delle piante e degli animali, che porta alla sintesi
transitoria di una serie di proteine dello shock termico. Queste proteine sono
particolarmente termoresistenti ed esercitano una azione stabilizzante sulle
proteine cellulari termosensibili.
I batteri presentano un'ampia varieta' nella loro richiesta
di ossigeno (atmosferico) gassoso. Alcuni non crescono in assenza di ossigeno, altri non si sviluppano in sua presenza ed alcuni possono adattarsi sia
alla presenza che all'assenza di ossigeno. Per i batteri aerobi
si dovra' assicurare la presenza di ossigeno (sara' necessario procedere ad
un'aerazione forzata, mediante immissione di aria sterile, delle colture dei
batteri aerobi obbligati in terreni liquidi dove, altrimenti, si avrebbe
sviluppo solo negli strati superficiali del terreno). Il rifornimento di aria
alle colture di germi aerobi e' un problema tecnico di vitale importanza; per
introdurre l'ossigeno nei terreni di coltura liquidi, si scuotono ripetutamente
i recipienti oppure si immette aria nel terreno mediante sistemi di aerazione o
di aspirazione. Quando i microrganismi raggiungono concentrazioni elevate (14 X
109UFC/ml), la presenza dell'ossigeno puo' diventare un fattore limitante per la
crescita degli aerobi. Al contrario per la coltivazione degli anaerobi
obbligati, si dovra' procedere alla eliminazione dell'ossigeno, cosa realizzabile
in vari modi: aggiungendo alle colture liquide delle sostanze riducenti come tioglicolato sodico, sigillando le provette contenenti agar con uno strato di
vaselina o paraffina, oppure ponendo il recipiente della coltura in un altro
recipiente dal quale viene asportato l'ossigeno per mezzo del vuoto o di
procedimenti chimici. In alternativa questi microrganismi possono essere
coltivati e manipolati usando speciali cappe munite di guanti, appositamente
costruite per le colture in anaerobiosi.
La maggior parte dei batteri richiede concentrazioni ottimali di ioni idrogeno,
anche se possono moltiplicarsi in un range ampio di pH. In gran parte i batteri
patogeni si sviluppano meglio a valori di pH compresi tra 6,0 e 8,0
(neutrofili), ma alcuni presentano un pH ottimale inferiore compreso tra 2,0 e
4,0 (acidofili) e altri pH ottimale tra 8,0 e 11,0 (basofili).
Spesso nei terreni si aggiungono sostanze tamponanti per mantenere il piu' a
lungo possibile il pH ottimale.
Spesso puo' risultare importante controllare la pressione osmotica o la concentrazione salina dell'ambiente in cui viene coltivato un microrganismo. I terreni di uso comune hanno caratteristiche soddisfacenti per la maggior parte dei microrganismi e generalmente questi si moltiplicano meglio in terreni con concentrazione osmotica piu' bassa della propria. Per i germi capaci di crescita in soluzioni, per esempio, ad elevata concentrazione di zucchero, la pressione osmotica e la forza ionica non devono essere trascurate. Vengono definiti alofili i microrganismi che vivono bene ad elevate concentrazioni di sali; gli osmofili, invece, richiedono una elevata pressione osmotica. La maggior parte dei batteri tollera forti escursioni di pressione osmotica e di forza ionica perche' sono in grado di regolare la loro concentrazione salina interna e la loro osmolalita'. L'osmolalita' e' regolata dal trasporto attivo di ioni K+ dentro la cellula, mentre la forza ionica interna e' mantenuta costante dall'escrezione della poliamina organica putrescina con carica positiva.