La cascata della coagulazione

Coagulazione nell'emostasi

La coagulazione è l'attivazione sequenziale a cascata di una serie di proteasi plasmatiche che porta alla trasformazione del fibrinogeno in fibrina, catalizzata dalla trombina. La fibrina, polimerizzando sotto l'azione del fattore XIII (una tipica transglutaminasi), forma un reticolo e, insieme con le piastrine aggregate e i globuli rossi intrappolati, costituisce il tappo emostatico o coagulo.

I vari aspetti di questa sequenza comprendono:
a) I fattori coinvolti, soprattutto le proteine coagulative, la loro natura, origine e localizzazione.
b) I meccanismi che attivano la cascata coagulativa.
c) La sequenza degli eventi biochimici.
d) La regolazione e il controllo della sequenza.
e) Le relazioni con gli altri sistemi dell'emostasi, come le piastrine, la parete dei vasi e il sistema fibrinolitico.

I fattori della coagulazione

Sono proteine che circolano nel sangue o sono legate a cellule (piastrine, endotelio, cellule di tessuti) in forma inattiva. Quando vengono attivate molte di esse mostrano un'azione proteasica, potendo riconoscere e opportunamente idrolizzare altri fattori inattivi nella sequenza coagulativa. Questi fattori vengono a loro volta attivati, fino alla trasformazione della protrombina in trombina. Quest'ultima trasforma il fibrinogeno in monomeri di fibrina che, infine, vengono polimerizzati e stabilizzati dal fattore XIII attivato, una transglutaminasi che arricchisce la fibrina monomerica di zuccheri, facilitandone la polimerizzazione. La sintesi delle proteine della coagulazione avviene nel fegato, mentre le cellule endoteliali sintetizzano il fattore di von Willebrand. La sintesi epatica della protrombina e dei fattori VII, IX e X è dipendente dalla presenza di vitamina K in una delle sue due forme K, o K2. La vitamina K, si ritrova nei cibi, la vitamina K2 viene sintetizzata dai batteri intestinali (colon), ambedue vengono assorbite soprattutto a livello dell'ileo terminale. Essendo ambedue liposolubili, è necessaria la presenza dei sali biliari. La vitamina K costituisce il coenzima essenziale per una carbossilasi del reticolo endoplasmatico della cellula epatica; questo enzima completa la sintesi dei fattori VII, IX, X e della protrombina, aggiungendo i gruppi y-carbossilici all'acido glutammico di questi polipeptidi. Questo evento post-traduzionale è importante perché tali gruppi sono necessari per l'aggancio dei fattori alla membrana piastrinica con la mediazione del Ca++. I geni per le proteine della coagulazione sono localizzati nei cromosomi autosomici, eccetto quelli per il fattore Vili e il fattore IX vicini al telomero del braccio lungo del cromosoma X.

Controllo della coagulazione

La coagulazione viene controllata mediante due principali meccanismi: a) il sistema fibrinolitico per l'inattivazione e/o la demolizione proteolitica della fibrina e dei prodotti delle diverse attività enzimatiche; b) il secondo è il sistema di inattivazione delle proteasi attive mediante inibitori a diversa specificità. Il principale effettore del primo meccanismo è il sistema fibrinolitico, nel secondo meccanismo agiscono le antiproteasi, come l'antitrombina III, la proteina C, la proteina S e altre molecole chiamate serpine, acronimo dall'inglese serio protesse inhibitors. Il sistema fibrinolitico, a sua volta, viene controllato strettamente da fini meccanismi di attivazione e inibizione retrograda.


 Il sistema fibrinolitico

 La fibrinolisi è un processo proteasico che permette il controllo della progressione dell'amplificazione della coagulazione e l'eliminazione del coagulo. Tale controllo deve avvenire nel tempo, in maniera da permettere che il danno vasale venga riparato. Si comprende quindi come la sua azione debba essere ben calibrata e controllata da rigorosi meccanismi retrogradi. Il sistema fibrinolitico comprende: a) il plasminogeno, il sub-strato da cui origina la plasmina o fibrinolisina; b) gli attivatori del plasminogeno; c) gli inibitori degli attivatori del plasminogeno; d) gli specifici inibitori della plasmina. Questi ultimi appartengono alla famiglia delle serpine. Il plasminogeno viene prodotto dal fegato e si ritrova nel sangue in forma inattiva. In seguito ad opportuna attivazione proteolitica dà origine alla plasmina o fibrinolisina. Gli attivatori del plasminogeno sono presenti nel plasma, nelle cellule endoteliali e in altri tessuti dell'organismo; derivano in genere dai lisosomi dei tessuti danneggiati e in necrosi e vengono definiti attivatori naturali del plasminogeno. Sono molecole ad attività enzimatica il cui sito attivo contiene una serina, perciò sono anch'essi delle serinproteasi come le proteine della coagulazione. Sono capaci di attivare direttamente il plasminogeno trasformandolo in plasmina; quest'ultima rappresenta l'enzima più efficiente per la demolizione della fibrina, sia monomerica che polimerizzata, in frammenti detti fibrinopeptidi. Tra gli attivatori naturali del plasminogeno da ricordare l'urochinasi, presente nel sangue e anche nelle urine e nei vari filtrati del nefrone, dove presiede all'importante funzione di mantenere pervio il lume dei tubuli renali, liberandolo dall'eventuale fibrina. Esistono anche attivatori esogeni del plasminogeno, tutti di origine batterica o farmacologica. Alcuni ceppi di stafilococchi e streptococchi emolitici producono rispettivamente stafilochinasi e streptochinasi; essi non sono serinproteasi; agiscono indirettamente mediante la preventiva formazione di un complesso attivatore+plasminogeno. Questo complesso invece possiede Vattività serin-proteasica capace di attivare altre molecole di plasminogeno. Quest'ultimo, prima che possa essere attivato, dev'essere adsorbito sulla superficie dei polimeri di fibrina da un attivatore naturale plasmatico o comunque legato sulle cellule endoteliali del luogo della lesione; anche la calli-creina generata nell'attivazione del F.XII può attivare il plasminogeno, se questo è adeso ai polimeri di fibrina. Gli attivatori del plasminogeno sono normalmente controllati da specifici inibitori, detti PAI-1 e PAI-2 (plasminogen activator inhibitor) che, legandosi agli attivatori del plasminogeno, limitano a monte la disponibilità di plasmina. Infine, l'attività della plasmina viene controllata direttamente da una serie di molecole inibitrici della famiglia delle serpine, presenti normalmente nel sangue in forma attiva. Tra queste risultano efficaci, grazie alla loro affinità per la plasmina, soprattutto l'a2-antiplasmina e, in misura minore, a2-ma-croglobulina e ì'antitrombina III. Da ricordare che l'AT-lll riconosce molti altri substrati, potendo controllare altri fattori attivi, come la trombina e i fattori Xlla, Xla e Xa.

 

Attivazione della coagulazione

I fattori della coagulazione agiscono in sequenza nell'ambito di due sistemi: il sistema intrinseco e il sistema estrinseco. I componenti del primo sono tutti presenti nel sangue. Il sistema intrinseco inizia con l'attivazione del fattore XII di Hagemann, la prima serin-proteasi che fa progredire la sequenza. Al sistema estrinseco partecipano componenti di derivazione esterna al sangue, provenienti dal tessuto danneggiato (fattore tissutale e componenti delle membrane) e la sua funzione è legata all'attivazione del fattore VII (che avviene con la formazione del complesso F.VII + Fattore tissutale). Dall'attivazione del fattore X in poi, la sequenza è comune ai due sistemi fino alla trasformazione del fibrinogeno in fibrina. I due sistemi, inoltre, presentano differenti vie di attivazione che rendono questa parte iniziale della sequenza molto complessa e ricca di alternative. In particolare, esistono almeno tre vie di attivazione del sistema intrinseco e due per quello estrinseco.
a) Il fattore XII viene attivato dall'adsorbimento (contatto) con il chininogeno ad alto peso molecolare (Fattore di Fitzgerald) e con le superfici subendoteliali cariche negativamente (collagene e altre molecole della matrice) ed eventualmente con tossine batteriche II fattore Xlla attiva il F.XI, iniziando con la sequenza del sistema intrinseco. Il F.XII attivato è coinvolto anche in altre vie biochimiche.
b) L'esposizione delle strutture sottoendoteliali e la liberazione di ADP, in seguito al danno tissutale, attivano le piastrine che possono attivare il F.XII, oppure direttamente il F.XI. Da qui procede la sequenza del sistema intrinseco.
c) I detriti cellulari circolanti, contenenti fattore tissutale, provenienti dal tessuto danneggiato possono attivare direttamente il fattore IX. A questo proposito, va ricordato che la massima efficienza, sia nell'attivazione che nello svolgimento del resto della cascata coagulativa, viene acquisita quando i fattori vengono ordinatamente legati ad una membrana da ponti Ca++ grazie ai gruppi y-carbossiglutamici dei fattori dipendenti dalla vitamina K (fattori VII, IX, X, e protrombina).
Le due vie per l'attivazione del sistema estrinseco sono ambedue confluenti nella formazione del complesso [fattore VII+fattore tissutale]. La prima è rappresentata dall'azione sinergica del contatto tra le superfici subendoteliali cariche negativamente e il fattore di Fitzgerald (chininogeno ad alto peso molecolare); essi attivano la precallicreina in callicreina, la quale a sua volta attiva il fattore XII e, quindi, il fattore VII, evidenziandone l'attività serin-proteasica per il fattore X. Tuttavia, la principale via di attivazione del fattore VII è rappresentata dalla diretta formazione del complesso con il fattore tissutale sulle membrane e organuli derivati dal tessuto danneggiato.

Sistema intrinseco e sistema estrinseco

Il sistema intrinseco è costituito dal fattore XII o fattore di Hagemann e dal chininogeno ad alto peso molecolare o fattore di Fitzgerald al quale sono legati il fattore XI e la precallicreina. Il fattore Xla attiva il fattore IX che, a sua volta, interagisce con il fattore VIII:C. Ambedue con l'intervento del Ca++ vengono legati alle piastrine e qui attivano il fattore X. Il fattore Xa si lega sulle piastrine al fattore V, formando un complesso stabile e attivo. Il F. V adsorbito dal plasma o secreto dai granuli a delle piastrine viene attivato a parte da una specifica proteasi piastrinica. Il fattore Xa presente in questo complesso è capace di attivare la protrombina adsorbita alle piastrine per mezzo del Ca++ e dei gruppi gamma-carbossil-glutamici e poi dividerla in due porzioni. Di queste, una rimane attaccata alle piastrine stabilmente per mezzo del Ca++, l'altra va in circolo come trombina, dove esplica le sue complesse funzioni. La trombina: a) induce ulteriore ed efficace aggregazione delle piastrine non ancora coinvolte; b) attiva ulteriormente il F.VIIhC e il fattore V aderenti alle piastrine; c) trasforma, soprattutto, il fibrinogeno in monomeri di fibrina; d) infine, attiva il fattore XIII responsabile della polimerizzazione stabile dei monomeri di fibrina. In conclusione, il sistema intrinseco svolge la sua azione sulla superficie delle piastrine aggregate e cioè dove è necessaria la formazione di fibrina e l'amplificazione della risposta piastrinica per la formazione del coagulo.
Nel sistema estrinseco il fattore X può essere attivato dal fattore VII attivo sulle membrane cellulari e su quelle degli organuli del tessuto danneggiato; questo fattore, a sua volta, viene attivato mediante formazione di un complesso equimolare dal fattore tissutale (o tissue factor), una proteina di tipo citochinico prodotta da quasi tutte le cellule dei tessuti che circondano i vasi, eccetto endotelio e leucociti. Il fattore XII attivo sembra capace di attivare il fattore VII direttamente sulle membrane cellulari.

Regolazione e controllo biochimico della coagulazione

La coagulazione è circoscritta nel punto di lesione del tessuto ed essa tenderebbe ad amplificarsi e a propagarsi fino a coagulare tutto il sangue, se non fossero presenti fattori inibenti che contrastano l'azione di quelli attivanti e amplificanti. La regolazione viene attuata da tre differenti sistemi: la famiglia di antipro-teasi dette serpine (o inibitori delle serin-proteasi), dal sistema fibrinolitico e dal sistema antifibrinolitico.
Tuttavia, la proteina F.VIII può essere presente in concentrazioni normali, ma risulta inattiva per mutazioni in siti cruciali per la funzione. Per esempio, sostituzioni aminoacidiche dei residui Arg372 e Argl689 risultano importanti nella perdita della capacità di attivare la trombina; la sostituzione della Tyrl709 con Cysl709 o della Tyrl680 con Phel680 impedisce la formazione del complesso F.VIII:C+vWF che, a sua volta, provoca la rapida demolizione del F.VIII in circolo.

L'emofilia A

Viene trasmessa dal cromosoma X come carattere recessivo; nella femmina eterozigote, non si manifesta la malattia, ma essa viene trasmessa al 50% della prole. Di questa, i maschi, nei quali vi è il solo allele patologico, manifestano la malattia con vari gradi di severità a seconda della penetranza del gene, e trasmettono il gene mutato a tutte le figlie femmine, ma a nessuno dei maschi. La diversa espressione dei due alleli X nelle femmine permette che il F. VIII sia mantenuto ad un livello vicino al 50% di quello normale e, quindi, che la malattia non sia clinicamente manifesta. I rarissimi casi di emofilia femminile clinicamente manifesta sono stati quasi tutti attribuiti ad alterata lionizzazione del cromosoma X. Sono anche stati descritti casi di emofilia A sporadici, non familiari. Questi evidenziano la possibilità di mutazioni sporadiche nelle cellule germinali dei genitori. La terapia dell'emofilia A è stata per anni attuata con concentrati di plasma di pazienti sani. Purtroppo questa via ha drammaticamente evidenziato la possibilità di trasmettere, attraverso questi derivati plasmatici, vari tipi di virus come HIV, virus B e C dell'epatite. Tecniche di biologia molecolare hanno permesso la produzione delle proteine ricombinanti umane necessarie a questi pazienti, senza le complicazioni e i pericoli dei concentrati plasmatici.

Emofilia B

è una malattia emorragica nella quale manca l'attività del fattore IX, legata, come l'emofilia A, al cromosoma X, come carattere recessivo. Presenta le stesse caratteristiche cliniche e genetiche dell'emofilia A. dalla quale è indistinguibile, se non si dispone di un adeguato e accurato studio del blocco coagulativo e delle attività dei fattori. Sono state descritte numerose varianti mutazionali simili nei meccanismi a quelli visti per il fattore VIII. In ambedue i casi di emofilia l'alterazione della sequenza coagulativa si manifesta per la mancata attivazione del fattore X e quindi con il blocco del sistema intrinseco. Il sistema estrinseco si presenta normalmente attivato. La diagnosi differenziale tra le due emofilie si esegue generalmente con la misurazione dell'attività dei due fattori o con esami di biologia molecolare, oggi entrati nella routine.
 

Malattie dipendenti da altri fattori della coagulazione

Sono malattie autosomiche dominanti di rarissima osservazione per le quali si rimanda ai testi di Patologia genetica.

Deficienze acquisite delle proteine della coagulazione

Sono malattie che nella maggior parte dei casi riguardano la cellula epatica e le sue capacità sintetiche; altre volte, la produzione è normale, ma i fattori vengono inattivati in circolo da specifici anticorpi o da iperfunzione dei sistemi di controllo o, infine, da farmaci, tossici e molecole inattivanti, presenti nel sangue.

Deficienze acquisite dei fattori dipendenti dalla vitamina K

La mancanza di vitamina K può essere dovuta a carenze alimentari (vitamina K,) o a deficiente produzione da parte della flora batterica intestinale (vitamina K2), come si verifica nel corso di terapie antibiotiche prolungate e improprie o di altre malattie intestinali in cui viene alterato l'equilibrio della flora batterica intestinale probiotica.
La carenza di vit. K rende inattiva la carbossilasi epatica. Questo enzima aggiunge gruppi y-carbossilici all'acido glutamico dei fattori coagulativi nascenti, rendendoli funzionali. In particolare, la mancanza di tali gruppi non permette alla trombina, ai fattori VII, IX e X di potersi legare, per mezzo di ioni Ca+ + , alle membrane piastriniche e a quelle cellulari liberate dai tessuti danneggiati. In queste condizioni, pertanto, in circolo si ritroveranno proteine coagulative non funzionali e alterate nella struttura. La sindrome emorragica che si manifesta può essere molto grave, ma viene rapidamente (anche solo qualche ora) risolta mediante somministrazione di vit. K. Oltre a questi fattori della coagulazione, si ritroveranno anche forme inattive della proteina C e della proteina S (vedi avanti).
 

Deficienze dei fattori della coagulazione nelle malattie epatiche

La cellula epatica sintetizza quasi tutte le proteine della coagulazione, inclusi i fattori non dipendenti dalla vit. K, e molte molecole di controllo con la sola eccezione del fattore di von Willebrand, dell'attivatore del plasminogeno e poche altre. Da questo si comprende che un danno anatomico o funzionale agli epatociti, che coinvolge la sintesi proteica, può rapidamente portare a una grave sindrome emorragica per deficienza dei fattori qui sintetizzati. Tale sindrome viene ulteriormente aggravata dalla Proteolisi Intravascolare Disseminata (o Coagulazione Intravascolare Disseminata), ehe più facilmente si scatena per la mancata sintesi degli inibitori sia della coagulazione che della plasmina antitrombina III, proteina C, proteina S, ecc.).

Malattie emorragiche indotte da sostanze anticoagulanti


Nelle terapie anticoagulanti, in caso di trombo-embolismo normalmente si utilizzano soprattutto due elassi di farmaci: i composti cumarinici (o warfarina)  e l'eparina. Ambedue possono dar luogo a eccessiva azione anticoagulante e conseguenti manifestazioni emorragiche. ai I composti cumarinici hanno azione antagonista alla vit. K, della quale sono analoghi chimici e con la quale competono a livello della carbossilasi, inattivandola. Perciò si avranno fattori della coagulazione (protrombina, F.VII, IX, X) e proteina C con diminuiti o assenti gruppi carbossilici, incapaci di legarsi alle membrane e di esplicare efficientemente la loro azione.
b) l'eparina è un mucopolisaccaride carico negativamente, presente nei granuli di basofili e mastcellule, che si lega da una parte all'antitrombina-III circolante e dall'altra alla membrana delle cellule endo-teliali, attivando così questa molecola. L'AT-III attivata inattiva la trombina e altri fattori (fattori Xlla, Xla, IXa, Xa e plasmina). Sinergico a questa azione è l'effetto trombocitopenico, probabilmente dovuto alla formazione di anticorpi an-tieparina e, quindi, all'adsorbimento del complesso eparina-anticorpo sulla membrana piastrinica. Sembra che tale evento sia capace di stimolare l'aggregazione in vivo, causando tromboembolismo e rapida caduta del numero delle piastrine circolanti.

Inattivazione da anticorpi dei fattori coagulativi

Le proteine della coagulazione presentano numerosi antigeni complessi specie-specifici. L'innescarsi di meccanismi autoimmuni, o in seguito a trasfusioni multiple, o trattamento coagulante con concentrati ematici di fattori, può indurre la formazione di autoanticorpi (IgG e/o IgM) neutralizzanti verso uno o più fattori. L'inattivazione che ne consegue è responsabile di manifestazioni emorragiche. Un esempio è dato dall'emofilia A con inibitore, in cui l'inibitore è costituito da uno specifico anticorpo contro il fattore VIII.

Alterazioni del controllo della coagulazione

Probabilmente il controllo dell'emostasi, e soprattutto della coagulazione, rappresenta il tallone di Achille dell'omeostasi nella specie umana. Il controllo della coagulazione si avvale di due principali sistemi: il primo di inattivazione e demolizione proteolitica delle diverse attività enzimatiche e della fibrina; il secondo di un sistema di antiproteasi che regola negativamente questa attivi:, proteolitica. Pertanto, le alterazioni del controllo della coagulazione comprendono le malattie del sistema fibrinolitico con manifestazioni cliniche variegate (ce prevalenza di sintomi emorragici) e le deficienze delle antiproteasi con manifestazioni di trombosi prevalentemente venosa. Sono state descritte numerose malattie genetiche riguardanti il controllo della coagulazione.

Deficienze degli inibitori della plasmina

Il principale inibitore della plasmina è l'alfa2-antiplasmina; anche l'alfa2-macroglobulina e, in misura minore, l'AT-III inibiscono la plasmina. La loro deficienza genetica o acquisita, permette un'azione eccessiva d: questa proteasi; ne conseguono eccessiva fibrinolisi e manifestazioni emorragiche da consumo dei fattori, specialmente del fibrinogeno. Tutte queste malattie, non sempre clinicamente ben distinguibili, vengono semplicemente indicate con il termine generale di smammi iperfibrinolitiche. E' stata descritta una sindrome emorragica familiare dovuta a deficienza genetica di avantiplasmina.

Meccanismo di azione della plasmina e proprietà dei fibrinopeptidi

La plasmina originata dal plasminogeno rimane attaccata alla fibrina, in maniera da degradarla progressivamente in vari frammenti (Fig. 61.17). In particolare, la plasmina scinde i legami covalenti tra i monomeri che formano il polimero di fibrina, liberando fibrinopeptidi di circa 90-50 kDa. Questi frammenti, una volta immessi in circolo, esercitano attività chemiotattica per macrofagi, neutrofili e altri leucociti, per cui ad essi viene riconosciuto un ruolo importante nella riparazione, nella patogenesi dei danni tissutali e nell'azione difensiva della risposta infiammatoria. La plasmina attiva anche altri sistemi proteasici come il complemento e il sistema del chininogeno, per cui è importante il suo ruolo nella progressione della risposta flogistica.
SERPINE: CONTROLLO DELLE SERIN-PROTEASI DELLA COAGULAZIONE
L'attivazione e l'amplificazione sono associate alla proprietà serin-proteasica dei vari fattori i quali da substrati diventano essi stessi enzimi. Poiché il sito attivo di questi enzimi contiene una molecola di serina, fattori attivati vengono anche designati con il termine comune di serinproteasi. La famiglia delle serinproteas comprende anche altre molecole non strettamente appartenenti alla cascata coagulativa. Va notato, infine, che il fibrinogeno, il fattore V, il fattore Vili, il fattore XIII e il chininogeno ad alto peso molecolare non sono serinproteasi. è necessario controllare l'attività di quest enzimi mediante le serpine che hanno azione inibitrice e regolatrice sull'attività serinproteasica (Fig. 61.18) La più importante è YAntitrombina III (AT-III), capace di agire sulla maggior parte dei fattori attivati e specialmente sulla trombina. Questo conferisce all'AT-lll un ruolo centrale non solo nella regolazione della coagulazione ma anche, quando la sua azione sia deficiente o assente, nella genesi dei fenomeni trombotici. Nella sua azione sulla trombina, l'AT-lll da sola risulta poco efficiente e lenta; mentre legata all'eparina eventualmente presente nel sangue, è in grado di inattivare rapidamente il sito attivo della trombina (Fig. 61.16). Per quest'ultima proprietà l'eparina, un mucopolisaccaride contenuto in grande quantità nei granuli delle mastcel-lule o granulociti basofili, assume un importante ruolo di cofattore inibitore della coagulazione. La proteina C (diversa dalla proteina C reattiva dell'infiammazione è presente nel sangue o adesa alle cellule endoteliali, viene prodotta dal fegato ed è anch'essa dipendente dalla vit. K per i gruppi y-carbossilglutamici necessar alla sua adesione alle membrane. Inattiva specificamente il fattore VIII e il fattore V che si libera nella zona della lesione.  In conclusione, sembra chiaro che in questo fine gioco di attività antagoniste o sinergistiche dei vari fattori tra loro risiede l'intrinseca capacità di regolazione e di modulazione della cascata coagulativa. La mancanza di uno di questi fattori può dare luogo a situazioni trombofiliche, oppure alla prevalenza del sistema fibrinolitico su quello coagulativo, causa di gravi manifestazioni emorragiche (vedi avanti Sindromi iperfibrinolitiche).