Patologie da prioni

Con il termine «prioni» (coniato da Prusiner per indicare agenti «patogeni» di natura esclusivamente proteica ma provvisti di proprietà infettanti) si definiscono gli ancora elusivi ed enigmatici agenti responsabili di una serie di encefalopatie «degenerative» dell'uomo e di alcuni animali, la cui trasmissibilità (o infettività ?), sia in condizioni sperimentali sia in condizioni «naturali», è provata al di là di ogni ragionevole dubbio. Le diverse encefalopatie da prioni sono caratterizzate, dal punto di vista istopatologico, dalla presenza di lesioni «degenerative» in una serie di distretti encefalici (diversamente coinvolti nei differenti fenotipi clinici di patologia) che si manifestano con la costante comparsa di vacuoli che originano nei dendriti neuronali e nella zona perinucleare dei neuroni e conferiscono al tessuto nervoso un aspetto spongioso (encefalopatie spongiformi). A queste lesioni si accompagnano l'atrofia e la perdita di cellule neuronali, un'intensa proliferazione delle cellule gliali e la frequente deposizione di fibrille di natura glicoproteica, in placche simili a quelle presenti nella degenerazione amiloide.


Le encefalopatie spongiformi sono malattie genetiche oppure infezioni

I «prioni» sono isoforme patologiche di proteine normali, presenti soprattutto nei neuroni, che hanno la loro origine primigenia nella presenza di mutazioni nel gene codificatore e che si accumulano nelle cellule neuronali, in particolare, danneggiandole irreversibilmente. Quello che rende assolutamente peculiare una siffatta situazione patologica è il fatto che l'inoculazione di sospensioni di tessuti contenenti «prioni» (o, come vedremo più avanti, anche la mera ingestione, ad esempio a scopo alimentare, di tessuti «infetti») è in grado di indurre la comparsa della patologia in soggetti «normali», i quali divengono, a loro volta, una potenziale sorgente di «infezione» per altri soggetti «normali», e così via.


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In altre parole, pur essendo il risultato di una «mutazione» in un gene normalmente presente nell'organismo, le proteine prioniche patologiche sono dotate della capacità, se introdotte in un organismo sano, di moltiplicarvisi (anche se, come vedremo, con un meccanismo replicativo assolutamente sui generis) e di indurvi la comparsa della patologia a prescindere, questa volta, dalla presenza di mutazioni nel gene codificatore.

Tutte le encefalopatie spongiformi sono trasmissibili come un'infezione

La prima encefalopatia spongiforme di cui è stata dimostrata l'infettività è stata una patologia animale, la cosiddetta «scrapie», che si manifesta spontaneamente nelle greggi di pecore o, meno frequentemente, di capre e che è nota da almeno un paio di secoli. La «scrapie» si manifesta clinicamente con atassia, tremori, cachessia e, nella maggior parte dei casi, con un intenso «prurito» che induce gli animali a grattare furiosamente i fianchi contro qualsiasi oggetto verticale (da qui il nome, in Inglese, di «scrapie»). La prova della natura «infettiva» della malattia, che sin dalla sua prima identificazione era già chiaramente suggerita dalla osservazione della frequente diffusione epizootica «orizzontale» della patologia nelle greggi, è stata ottenuta nel 1936 quando Cuillé e Chelle dimostrarono, per la prima volta, la trasmissione della scrapie ad una capra sana con la inoculazione intraoculare di midollo spinale proveniente da una capra affetta dalla patologia. è stato, tuttavia, necessario che trascorressero più di 20 anni da questa osservazione, prima che anche per le encefalopatie spongiformi umane fosse riconosciuta la natura «trasmissibile» del probabile «agente eziologico». Solo sul finire degli anni 1950, infatti, gli studi su una peculiare forma di atassia progressiva, con prevalenti sintomi cerebellari, presente con andamento endemo-epidemico in una popolazione Papua (la tribù dei «Fore») residente nella zona montagnosa interna della Nuova Guinea, e nota localmente con il nome di «kuru», hanno posto le basi delle attuali conoscenze sulle patologie umane da prioni. Queste ricerche, condotte principalmente da Carleton Gajdusek, partendo da alcune osservazioni istopatologiche che suggerivano un'assoluta identità delle lesioni encefaliche dei soggetti affetti da «kuru» con quelle presenti negli animali affetti da «scrapie», hanno stabilito che il kuru può essere sperimentalmente trasmesso dall'uomo malato ad alcuni primati (scimpanzè).

Le ricerche di Gajdusek, infatti, hanno dimostrato che l'inoculazione intracerebrale nei primati, di sospensioni di tessuto nervoso centrale proveniente da pazienti deceduti per kuru, provoca, dopo un lungo periodo di incubazione (1-1,5 anni), la comparsa di manifestazioni cliniche ed anatomo-patologiche molto simili a quelle presenti nella patologia umana. Ma non solo. Le ricerche di Gajdusek, infatti, hanno anche consentito di ricavare convincenti indicazioni epidemiologiche sulla possibilità che l'andamento endemo-epidemico del «kuru» nella popolazione Papua fosse provocata e mantenuta dalla trasmissione «orizzontale» della patologia, a causa di una serie di pratiche di «cannibalismo rituale», suggerendo così anche la possibilità di una «trasmissione interumana» e per «via alimentare» della patologia. Partendo da queste rilevazioni, è stata successivamente dimostrata, mediante inoculazione intracerebrale nelle scimmie, di tessuti in particolare di tessuto nervoso centrale (cervello, midollo spinale) ma anche di tessuti di provenienenza oculare, epatica, renale, splenica e linfonodale provenienti da pazienti deceduti per encefalopatie spongiformi, la trasmissibilità sperimentale delle «encefalopatie spongiformi» umane presenti in tutto il mondo e rappresentate dalla malattia di Creutzefeldt-Jacob (CJ) e dalla malattia di Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), note da tempo, nonché dalla Insonnia Familiare Fatale (FFI = Fatal Familial Insomnia) descritta (dai ricercatori della Clinica Neurologica dell'Università di Bologna) in epoca relativamente recente (seconda metà degli anni 1980). La CJ è una rara (1 caso/anno/106 individui) forma di «demenza pre-senile» descritta nel 1920 e clinicamente caratterizzata da variabili segni di declino delle capacità motorie e cognitive e da una rapida (dal momento della comparsa dei primi sintomi) evoluzione letale della patologia. Nella grande maggioranza dei casi la malattia si presenta in casi isolati (CJ-sporadica o idiopatica) mentre occasionalmente (circa il 10% dei casi) presenta una chiara impronta «familiare» (CJ-familiare, descritta nel 1924) a trasmissione ereditaria, autosomica dominante.

La GSS (costantemente ad incidenza «familiare») può essere considerata una varietà della CJ, con prevalenti sintomi cerebellari (atassia) ed una molto più intensa presenza nel tessuto nervoso centrale di «placche» amiloidotiche formate dana'deposizione di fibrille di natura glicoproteica, mentre la FFI (probabilmente già descritta In passato come «pure thalamic dementia») - della quale nel 1999 sono stati descritti anche alcuni casi di patologia «sporadica» (s-FI o sporadic Fatal Insomnia) non riconducibile, quindi, ad una trasmissione ereditaria, è caratterizzata, oltre che da una chiara impronta genetica «familiare», da una consistente presenza di lesioni talamiche. Intorno agli anni 1970, inoltre, è stata dimostrata anche la trasmissibilità interumana della CJ (per inoculazione accidentale - in conseguenza, purtroppo, di interventi sanitari di vario tipo - di materiale umano proveniente da soggetti «infetti») attraverso l'inaspettata e drammatica rilevazione di una serie (poco meno di 300, fino alla metà degli anni 1980) di casi di CJ-iatrogena, in pazienti trattati con ormone della crescita o gonadotropine di origine estrattiva (dalle ipofisi di cadaveri di soggetti che, evidentemente, erano affetti da CJ, ancorché clinicamente ancora non evidente), in soggetti sottoposti ad allotrapianti di cornea o di «dura madre» (i cui «donatori» erano evidentemente nelle stesse condizioni) o in pazienti trattati neurochirurgicamente con elettrodi stereotassici (utilizzati in precedenza su pazienti con ogni probabilità affetti da CJ in fase preclinica e non sterilizzati adeguatamente). D'altro canto, anche per quanto riguarda la patologia animale, a parte la scrapie di cui abbiamo già detto - e con la eccezione di alcuni casi spontanei di encefalopatie spongiformi (la cosiddetta «cachessia cronica» o CWD: chronic wasting disease) evidenziati in animali (alce, cervo) presenti allo stato brado in alcuni parchi degli USA (Colorado, Wyoming) e di origine incerta -le altre forme di encefalopatie spongiformi animali sino ad ora descritte - sia che si tratti di casi sporadici o più o meno consistenti focolai epidemici di encefalopatie spongiformi come quelli descritti, rispettivamente, in animali (ungulati) esotici in cattività negli Zoo, in felini domestici (FSE: feline spongiform encephalopathy) 0 nei visoni in allevamento (TME o Transmissible mink encephalopathy), sia che si tratti della recente, drammatica, epidemia di encefalopatia spongiforme che, a partire dal 1986, ha colpito, con centinaia di migliaia di casi, i bovini (BSE: bovine spongiform encephalopathy) in allevamento intensivo in Gran Bretagna (e con più modesti focolai in Irlanda, Portogallo, Svizzera, Francia ed altri Paesi europei) - sembrano tutte imputabili ad «infezioni esogene» contratte per «via alimentare» in seguito alla introduzione, nella catena alimentare animale, di materiali provenienti da animali portatori di patologie di questo tipo. Per quanto riguarda la fiSE, che, come abbiamo detto, ha avuto inizio in Gran Bretagna nel 1986, si presume - ma probabilmente non si riuscirà mai a provarlo in modo incontrovertibile - che il «prione» della BSE abbia avuto la sua origine nel «prione» della «scrapie» (enzootica nelle greggi inglesi) che avrebbe fatto il «salto di specie» quando, all'inizio degli anni 1980, il processo utilizzato per la trasformazione degli scarti della macellazione degli ovini in vari sottoprodotti, tra i quali anche, e soprattutto, «farine proteiche» utilizzate come integratori dell'alimentazione dei bovini in allevamento intensivo, è stato modificato con l'eliminazione della estrazione dei grassi animali (sevo) mediante solventi a base di petrolio utilizzati a temperature elevate (procedimento che era evidentemente in grado di «inattivare» il prione della scrapie) causando l'immissione nella alimentazione bovina di materiali ancora «infettanti». La comparsa, negli allevamenti inglesi, dei primi bovini affetti da BSE e l'avventata immissione degli scarti di macellazione, o delle intere carcasse, di questi animali, nel processo di produzione delle farine proteiche che hanno continuato ad essere usate nell'alimentazione animale, avrebbe enormemente amplificato il processo, portando alla drammatica epizoozia di encefalite spongiforme bovina negli allevamenti inglesi dai quali, attraverso il commercio degli animali, delle carni e delle «farine proteiche», essa si sarebbe estesa anche ad altri Paesi europei. L'importanza della BSE - che, nonostante una serie di misure di controllo, che si sono andate inasprendo con gli anni (abbattimento ed incinerazione dei bovini infetti o sospetti tali, proibizione dell'impiego zootecnico di «farine animali», divieto di produzione di «farine animali» e distruzione delle scorte esistenti) non è ancora completamente eradicata - non consiste solo nei danni al patrimonio zootecnico, ma risiede soprattutto nel paventato rischio di una trasmissibilità animale-uomo della patologia attraverso l'impiego alimentare di carni bovine. A partire dal 1995-96, infatti, è stata individuata (a tutt'oggi sono stati descritti più di un centinaio di casi, di cui la grandissima maggioranza in Gran Bretagna, alcuni casi in Francia ed almeno uno in Irlanda) una nuova forma di encefalopatia spongiforme umana che è stata denominata - forse non del tutto propriamente, date le peculiarità cliniche ed anatomo-patologiche che la distinguono significativamente dalla Creutzefeldt-Jacob familiare o sporadica - nuova variante (della malattia) di Creutzefeldt-Jacob o CJ-nv (Creutzefeidt-Jacob new-variant). La malattia, il cui inizio è accompagnato da sintomi psichiatrici, che presenta un decorso relativamente protratto (fino a 38 mesi dall'inizio della sintomatologia alla morte del paziente) e che dal punto di vista istopatologico è caratterizzata dalla presenza di placche amiloidotiche «floride» (formate da un denso «core» di depositi amiloidotici circondato da numerosi vacuoli), è stata osservata insorgere «spontaneamente» (in assenza cioè di possibili cause di origine iatrogena, come ad esempio la somministrazione, nell'infanzia, di ormone della crescita di origine estrattiva umana) in soggetti di relativamente giovane età (età media 27 anni), rispetto all'età di insorgenza della CJ sporadica (età media 65 anni). Come diremo ancora più avanti, la CJ-nv - sia per le evidenze epidemiologiche [la patologia è stata sino ad ora riscontrata solo nelle popolazioni residenti nelle zone prevalentemente interessate dalla epidemia di encefalite spongiforme dei bovini (BSE) e con un'incidenza direttamente proporzionale alla diffusione della patologia animale], sia per alcune caratteristiche del «prione» coinvolto - viene con ragionevole presunzione considerata la conseguenza di una «infezione esogena» contratta per «via alimentare», a seguito della assunzione di cibi confezionati con materiali provenienti da bovini affetti da BSE.

Eziopatogenesi delle patologie da  «PRIONI» X


I numerosi esperimenti iniziati già sul finire della prima metà del secolo scorso, condotti nel tentativo di «isolare» il o i «virus» ) responsabili delle encefalopatie spongiformi, e le ricerche sulla eziologia della «scrapie», pur assolutamente deludenti sotto questo profilo, hanno tuttavia dimostrato in maniera abbastanza sorprendente che il potere infettante sperimentale del nevrasse di animali deceduti per encefalopatia spongiforme era non solo resistente a tutta una serie di trattamenti in grado di inattivare i virus convenzionali (anche campioni di tessuto nervoso conservati da tempo in formalina si sono mostrati in grado di trasmettere la patologia), ma anche assolutamente resistente a qualsiasi trattamento in grado di inattivare gli acidi nucleici; inoltre, si dimostrava sensibile, almeno in parte, ad alcuni trattamenti in grado di denaturare le proteine (urea, fenoli, etc), per cui era giocoforza concludere che l'elusivo «agente infettante», probabilmente costituito da una «proteina» particolarmente resistente a diversi trattamenti «denaturanti», doveva essere privo di un genoma (o almeno di un genoma «convenzionale») e che la sua replicazione non poteva che seguire una strada assolutamente peculiare. A partire dall'inizio degli anni 1980, grazie alla messa a punto di più agevoli modelli sperimentali realizzati con la dimostrazione della possibilità di trasmettere l'affezione nel topino o in altri piccoli roditori come il criceto (dove la patologia si manifesta nel giro di alcune settimane o di alcuni mesi e non di anni, come nei primati) ed alla disponibilità di più sofisticate tecniche di analisi molecolare, si è ottenuta la dimostrazione che la trasmissibilità sperimentale della patologia coincide con una proteina parzialmente glicosilata, formata da 253 aminoacidi e del peso molecolare di 33-35 kDa, che è stata denominata PrP (proteina prionica). La determinazione della sequenza aminoacidica della PrP associata allo «scrapie» o PrPSc, ottenuta nel 1984, ha consentito di scoprire che le cellule dei mammiferi contengono un gene (Prnp) che codifica una proteina molto simile, che e stata quindi denominata proteina prionica cellulare o PrPc. La proteina «prionica» normale (PrPc) dell'uomo, codificata dal gene Prnp localizzato sul braccio corto del cromosoma 20, è costituita da 253 aminoacidi, ha un peso molecolare di 33-35 kDa, ed è glicosilata (glicoproteina) a livello di due asparagine in posizione 181 e 197. Durante la traduzione, la PrPc viene addizionata di un gruppo di glicosil-fosfatidil-inositolo con il quale essa si ancora alla membrana delle cellule, alla cui superficie viene normalmente posizionata. La PrPc è presente soprattutto sulla membrana cellulare dei neuroni, ma livelli minori di espressione sono stati dimostrati anche a livello dei polmoni, del cuore, dei reni, del pancreas, dei testicoli, dei leucociti e delle piastrine. Il suo ruolo fisiologico è ancora da definire, anche se esiste qualche evidenza di un suo possibile intervento nella funzione sinaptica e nel legame del rame (copper-binding protein) e, inoltre, sulla base di alcune osservazioni che ne avrebbero dimostrato un'attività enzimatica superossido-dismutasica, è stata anche avanzata l'ipotesi che la PrP potrebbe svolgere un ruolo diretto nella protezione della cellula dallo stress ossidativo. Le due isoforme, normale e patologica, di PrP non presentano sostanziali differenze biochimiche a parte una massa minore (27-30 kDa) della PrP patologica, per la perdita di alcune sequenze aminoacidiche agli estremi C- ed N-terminali. Esse differiscono però nella conformazione molecolare e cioè, mentre la PrPc presenta una notevole presenza di siti molecolari nella conformazione cosiddetta ad «a-helix», la PrPSc (tutte le proteine prioniche patologiche e non solo quella della scrapie, sono denominate PrPSc o PrPTse da Transmissible spongiform encephalopathy o PrP-res da protease-resistant. Anche la PrPc è talora indicata come PrP-sen da protease-sensitive) presenta una prevalenza di siti molecolari che si presentano "srotolati" (unfolded) nella conformazione cosiddetta a «B-sfteet» e queste differenze conformazionali sono accompagnate dalla presenza, nella PrPSc, di una notevole resistenza alla digestione con enzimi proteolitici. Le proteine prioniche patologiche, formate da frammenti proteasi-resistenti di circa 145 aminoacidi, nelle cellule (nervose, in particolare] dei vertebrati con encefalo-patie spongiformi, si ritrovano aggregate in formazioni fibrillari depositate in ammassi (placche] che sovente sono contenuti all'interno di vacuoli citoplasmatici.
Nei tessuti degli animali infettati sperimentalmente, solo una parte della PrP è presente nella isoforma PrPSc, ma è solo quest'ultima ad essere infettante. Nella trasmissione sperimentale di «prioni» da una specie ad un'altra, la prima inoculazione provoca la comparsa di sintomi morbosi solo dopo un periodo di «incubazione» molto lungo, o può anche non portare alla comparsa di sintomi morbosi. Nel caso di una trasmissione effettuata con successo, i passaggi successivi del materiale (tessuto nervoso centrale) «infetto» in altri animali della specie ricevente si accompagnano ad una progressiva riduzione del periodo di incubazione che finisce con lo stabilizzarsi intorno ad un preciso periodo di tempo. Se, a questo punto, si prova a ritrasmettere l'infezione alla specie di origine, si osserva ancora il ripetersi dello stesso andamento del periodo di incubazione (molto lungo all'inizio e, via via, più breve in seguito) nella serie di inoculazioni successive. Questo risultato, che indica l'esistenza di una sorta di «barriera di specie» (apparentemente legata alla presenza di differenze nella sequenza aminoacidica della PrP di specie diverse) alla trasmissione dei prioni insieme al fatto che la sequenza della PrPSc è sempre quella della PrPc codificata dalle cellule dell'animai ospite e non quella della Prp patologica utilizzata con inoculo iniziale, indica chiaramente che la trasmissibilità dei prioni è un fenomeno che richiede la cooperazione della PrP normale codificata dall'organismo ospite con la PrP patologica esogena. Una definitiva conferma di questa conclusione deriva dagli esperimenti condotti in animali «knockout Prnp0/0 (animali con un'ampia o totale delezione (knockout), indotta artificialmente, del gene codificante la PrP] cioè incapaci di produrre PrPc. Questi animali, infatti, non solo non presentano la comparsa «spontanea» di un'encefalopatia spongiforme - dimostrando così che la causa della patologia non è l'assenza o l'inibizione della PrP normale. Inoltre risultano assolutamente resistenti alla inoculazione di «prioni» in grado di indurre la comparsa della patologia negli stessi ani mali con una normale capacità di produrre PrPc, il che dimostra che non è la Prp patologica esogena, a «moltiplicarsi» nell'organismo ospite e che la comparsa a PrP50 e della relativa patologia richiedono la presenzi della PrP normale. Gli esperimenti di trasmissione di PrPSc in anima li transgenici (animali nel cui genoma sono artificialmente inserite diverse copie del gene Prnp di una specie animale diversa e che sono, quindi, in grado di produrre la PrPc della specie animale da cui proviene i gene «esogeno») hanno inoltre dimostrato che la «barriera di specie» può essere superata se in un animali sono presenti geni «eterologhi» in grado di codificare la PrPc della stessa specie dell'animale da cui provieni l'inoculo, indicando così che le probabilità di «trasmissione» dei «prioni» sono tanto più elevate quanto più elevata è la «affinità» tra la PrP «patologica» inoculate e la PrP «normale» prodotta dall'organismo ricevente. Dall'insieme di queste osservazioni, emerge chiara mente che i «prioni» che si ritrovano negli animali da esperimento inoculati con materiali «infettanti» sono in realtà, il risultato di una modificazione conformazionale (post-traduttiva) delle molecole di PrPc, prodotte normalmente dall'organismo ricevente, per azione d «prioni» esogeni presenti nel materiale inoculato e che tale modificazione è tanto più efficiente e rapida (barriera di specie) quanto maggiore è l'affinità' ) tra le due PrP, rispettivamente normale (endogena) e patologica (esogena). Sulla base di questo insieme di dati sperimentali, è stato elaborato il modello di «replicazione» dei prioni delle encefalopatie spongiformi umane o animali «trasmissibili» - sia che la trasmissione sia il risultato di una «spontanea» infezione «orizzontale» (il che, più frequentemente, si verifica per via alimentare), sia che essa avvenga sperimentalmente per inoculazione di materiali «infetti» in animali da laboratorio. Secondo questo modello (che è un modello che presenta ancora alcuni aspetti ipotetici) la PrPc viene ciclicamente sintetizzata e degradata durante lo svol-gimento del normale metabolismo cellulare (nel quale, come abbiamo detto, essa svolge funzioni ancora da definire chiaramente). Fluttuazioni meramente stocastiche nella modificazione post-traduttiva della struttura di PrPc potrebbero portare alla formazione di rare molecole monomeriche, parzialmente «srotolate» (PrP*) che rappresenterebbero una fase intermedia instabile (peraltro, ancora, fisicamente non dimostrata) di possibile transizione verso la forma molecolare con ampie porzioni a fisheet caratteristica della PrPSc. Le molecole di PrP*, di norma, ritornerebbero alla conformazione molecolare «normale» o sarebbero degradate nel catabolismo cellulare. Nelle encefalopatie spongiformi «trasmissibili» (naturalmente o sperimentalmente), i «prioni esogeni» avrebbero la capacità - in presenza di una sufficiente «affinità» con la PrP prodotta nell'organismo, ovverosia in assenza di un'efficace «barriera di specie» - di favorire la transizione della PrP* verso la forma PrPSc definitiva, con il progressivo accumulo citoplasmatico di aggregati oligomerici «fibrillari», proteasi-resistenti di PrPSc ed il danneggiamento irreversibile della cellula' ).

Schema del meccanismo per la formazione degli accumuli intracellulari di proteina prionica patologica nella trasmissione orizzontale

In altre parole ogni «prione» (PrPSc) esogeno, legandosi ad una molecola PrP* dell'ospite, ne «catalizzerebbe» la definiva transizione verso la conformazione PrPSc, con la produzione finale di due molecole di PrPSc. Queste sarebbero in grado, a loro volta, di «catalizzare» la definitiva transizione a PrPSc di altre due molecole di PrP*, e così via, determinando nei tessuti dell'organismo «infetto» il conseguente incremento «esponenziale» di nuovi «prioni» che si originano dalla PrPc dell'organismo ospite grazie alle molecole nella conformazione instabile PrP*. Dopo un periodo di tempo (periodo di incubazione) sufficiente all'accumulo delle quantità di PrPSc necessarie ad indurre danni cellulari irreversibili, nell'organismo ospite compaiono i sintomi morbosi (soprattutto a carico del nevrasse) ed i suoi tessuti (in particolare il tessuto nervoso) contengono sufficienti quantità di PrPSc, derivata dalla PrPc prodotta nell'organismo stesso, per poter riprodurre la patologia se trasmessi ad un altro organismo, soprattutto se della stessa specie.
Nelle encefalopatie spongiformi umane a carattere familiare, invece, in cui è chiaramente accertata la trasmissione «ereditaria» autosomica e dominante (circa il 10% dei casi di CJ, tutti i casi di GSS e FFI) il processo patogenetico è costantemente legato alla presenza di specifiche mutazioni nel gene Prnp e si svolgerebbe nel modo seguente: nei soggetti portatori di una mutazione (in genere si tratta di mutazioni puntiformi o, meno frequentemente, di mutazioni da inserzione/delezione] nel gene che codifica la PrP, la PrPc che si produce (APrPc) presenta modificazioni della sequenza aminoacidica che diminuiscono le probabilità che la PrPc assuma un «normale» assetto conformazionale, aumentando, invece, le probabilità di transizione della PrPc nella forma PrP* (APrP*) e della sua definitiva conversione nella conformazione «prionica patologica» (APrPSc). è possibile che, anche in questi casi, le proteine «prioniche» (APrPSc) neoformate (endogene] intervengano, a loro volta, nel «catalizzare» la definitiva conversione di altre molecole di APrP* in APrPSc, con l'innesco di un perverso circuito che, sia pure lentamente (normalmente si tratta di patologie che compaiono in età «pre-senile») conduce all'accumulo di proteine «prioniche», soprattutto a livello del tessuto nervoso centrale, ed alla comparsa di danni cellulari che, tuttavia, una volta raggiunta la soglia critica per la loro estrinsecazione in una sintomatologia clinica conclamata, sono generalmente seguiti dalla morte del soggetto in breve volgere di tempo. Nelle forme «sporadiche o idiopatiche» di encefalopatie spongiformi umane (circa il 90% dei casi di CJ, più i pochi casi di s-FI descritti recentemente] non sono invece riscontrabili mutazioni del gene Prnp (come è, invece, il caso, ripetiamo, nelle forme «familiari» che, essendo la conseguenza di un danno genetico trasmissibile ereditariamente, presentano un gene Prnp «mutato» già nelle cellule germinali] e tutti i tentativi di tracciarne l'origine in una possibile esposizione a particolari fattori ambientali (origine «esogena») hanno dato risultati scoraggianti, per cui è giocoforza ammettere che la patologia sia il risultato di mutazioni «somatiche» (che occorrono solo nelle cellule neuronali coinvolte dalla patologia) o di stocastici (casuali) incrementi nel ritmo di conversione «spontanea» di PrP* in PrPSc, con l'innesco di un circuito che ripete, nelle sue tappe essenziali, quanto abbiamo già descritto in precedenza. Va però sottolineato come la recente (2004) scoperta nel bovino di un nuovo prione che somiglia, sia per le intrinseche caratteristiche sia per il tipo di patologia indotta naturalmente nell'animale (encefalopatia spongiforme amiloidotica bovina), a quello della forma «sporadica» di CJ, potrebbe fornire una traccia per giungere alla tanto ricercata eziologia «esogena» della patologia umana. Per quanto riguarda i casi di CJ nuova variante, descritti di recente (soprattutto in Gran Bretagna, come abbiamo detto) essi sono al momento considerati ascrivibili alla «infezione» da prioni esogeni, introdotti nell'organismo per ingestione di carni bovine provenienti da animali affetti da «encefalopatia spongiforme» (a sua volta innescata dall'alimentazione degli animali in allevamento con «farine» di origine animale). L'eziologia da «infezione» esogena della CJ-nv umana trova solide motivazioni non solo sotto il profilo epidemiologico, per la chiara correlazione spazio-temporale con la presenza della epidemia di BSE negli animali di allevamenti intensivi a scopo alimentare, ma anche sotto il profilo eziologico. Infatti, nonostante dati recenti (1999) sulla mancata trasmissibilità dell'infezione da prioni della BSE a topi transgenici per la PrPc umana sembrassero deporre per l'esistenza di una «barriera di specie» bovino-uomo non facilmente superabile, osservazioni ancora più recenti - che hanno dimostrato non solo che il prione della BSE è facilmente trasmissibile (come era prevedibile) a topi transgenici per la PrPc bovina, ma che anche il prione della CJ-nv è facilmente trasmissibile agli stessi topi nei quali provoca una patologia identica, sotto ogni profilo, a quella indotta dal prione di origine bovina, risultando inoltre praticamente indistinguibile da quest'ultimo, dopo un unico passaggio nel topo transgenico (mentre presenta significative differenze nella composizione aminoacidica rispetto alla proteina prionica patologica presente nei casi di CJ-sporadica] - indicano con ragionevole evidenza una significativa affinità del prione della CJ-nv con quello della BSE ed hanno drammaticamente proposto la possibilità che, nel corso degli ultimi quindici-venti anni, un gran numero di esseri umani possa essere stato «esposto», per via alimentare, al prione della BSE, con la conseguenza che, al momento, almeno la quota di soggetti con possibili fattori genetici predisponenti (ad esempio, soggetti con omozigosi Met/Met a livello del codone 129 di Prnp - si veda in seguito) si trovi nella «fase di incubazione» della patologia e sia quindi prevedibilmente destinato a far consistentemente aumentare i casi di CJ-nv clinicamente conclamata nei prossimi anni.
 

Predisposizione genetica alle malattie da «prioni»

Un possibile fattore di aumentata predisposizione genetica dell'uomo alla comparsa delle encefalopatie spongiformi è individuabile nel «polimorfismo» presente a livello del «codone» in posizione 129 nel gene Prnp, dove può essere normalmente presente sia il codone per l'aminoacido valina (Val), sia il codone per l'aminoacido metionina (Met). Nella popolazione caucasica la distribuzione dei relativi genotipi è del 37% per Met/Met, del 51% per Met/Val e del 12% per Val/Val (ovverosia circa il 50% dei genotipi è omozigote per Met o per Val, e circa il 50% è eterozigote). In contrasto con la distribuzione nella popolazione generale, la frequenza di omozigosi (Val/Val o Met/Met) nei casi di CJ-sporadica è di circa il 90%, configurandosi così l'omozigosi a livello del codone 129 di Prnp come un probabile «fattore di rischio» per l'insorgenza della patologia. Non si può comunque sottacere che in alcune popolazioni, come quella giapponese, la elevata frequenza di omozigosi Met/Met nei casi di CJ sporadica è mascherata dall'elevata frequenza del fenomeno nella popolazione normale. Poiché l'incidenza di CJ-sporadica in Giappone non è più elevata che altrove, è necessario ammettere che l'omozigosi a livello del codone 129, non sia di per sé un elemento predittivo della malattia, ma rappresenti piuttosto solo un importante fattore predisponente, in grado di agire solo in concomitanza con l'esposizione ad altri «fattori» (?) essenziali per la comparsa della patologia. Oltre a rappresentare un possibile fattore di rischio per la comparsa della patologia, il genotipo a livello del codone 129 di Prnp sembra anche in grado di influenzare il fenotipo clinico della CJ-sporadica. Una omozigosi Met/Met, infatti, è infatti generalmente associata con un forma di demenza rapidamente progressiva, mentre il genotipo Val/Val è più frequentemente associato ad un decorso più prolungato e con prevalenti sintomi iniziali di atassia. Un'elevata frequenza di omozigosi (Met/Met o Val/ Val) a livello del codone 129 di Prnp è stata dimostrata anche nei casi di CJ di origine iatrogena, associati alla somministrazione di ormone della crescita di origine estrattiva umana, e - dato di assoluto rilievo - in tutti i casi di CJ nuova-variante è stata riscontrata una costante presenza di omozigosi Met/Met a livello del codone 129 di Prnp, il che dimostra che il polimorfismo a livello del codone 129 di Prnp può svolgere il ruolo di fattore gene-tico predisponente anche nei confronti della patologia da prioni esogeni, risultando evidentemente in grado di influenzare l'interazione tra proteina prionica patologica (di origine esogena) e proteina prionica normale. Anche nelle encefalopatie spongiformi a carattere «familiare» (a trasmissione ereditaria), l'omozigosi a livello del codone 129 sembra in grado di influenzare il quadro anatomo-clinico della patologia. Essa, infatti, è significativamente associata ad una patologia con un esordio ad un'età relativamente minore e con un decorso più aggressivo. Come se non bastasse, il polimorfismo a livello 129 sembra anche in grado di condizionare il fenotipo clinico della patologia, pur in presenza della stessa mutazione nel gene che codifica la proteina prionica. Ad esempio, la mutazione (dominante nella CJ e nella FFI) «D178N») [mutazione a livello del codone 178 di Prnp che comporta una transizione da aspartato (D) ad asparagina (N) nella PrP] in presenza di Val in posizione 129 nella PrP provoca una malattia che assume il fenotipo della CJ-familiare (caratterizzata da una PrPSc con una migrazione elettroforetica compatibile con una massa di 21 kDa) mentre in presenza di Met induce una patologia con il fenotipo della FFI (con una Pr-PSc con una migrazione elettroforetica compatibile con una massa di 19 kDa). Queste osservazioni suggeriscono che la patologia fondamentale (encefalopatia spongiforme) è dovuta alla mutazione dominante D178N, ma che le diverse forme cliniche con le quali la patologia di base si manifesta fenotipicamente sono influenzate dai diversi sottotipi conformazionali della PrPSc, a loro volta determinati dall'aminoacido (Met o Val) presente a livello del codone 129, evidentemente in grado di condizionare la conformazione definitiva del la proteina prionica patologica.
 

Diagnosi e trattamento

Il sospetto di una malattia da «prioni» è legittimo in ogni paziente che presenti un progressivo (subacuto) declino di funzioni cognitive e/o motorie. Nella patologie da «prioni» non sono presenti fenomeni infiammatori e non si ha produzione di anticorpi o, comunque, l'innesco di una evidente reazione immunitaria umorale o cellulo-mediata (la proteina prionica «patologica» non differisce da quella «normale» in modo sufficientemente significativo per essere riconosciuta come not self. La diagnosi è generalmente clinica. Dal punto di vista della diagnosi «eziologica» di laboratorio, il test diagnostico più attendibile consiste nella ricerca della PrPSc umana, mediante antisieri immuni specifici, preparati artificialmente in animali da laboratorio'165, in prepa-razioni di Western-blot (si veda pag. 56) allestite da un campione bioptico di materiale cerebrale, precedente-mente esposto all'azione di enzimi proteolitici per eli-minare la PrPc (si tratta comunque di un test di impiego limitato a casi particolari dai quali sia possibile ottenere materiali adeguati, mediante biopsia cerebrale). La diagnosi post-mortem può avvantaggiarsi di re-azioni di Western-blot in prelievi autoptici di tessuto cerebrale coinvolto da lesioni spongiformi (sempre previo trattamento proteolitico per eliminare la PrPc) o, eventualmente, della ricerca della PrPSc (proteasi-resistente) umana mediante reazioni immunoistochi-miche nelle placche amiloidotiche. Nelle patologie con una chiara impronta familiare l'analisi del gene Prnp (amplificato mediante PCR ed analizzato mediante sequenziamento della composizione nucleotidica) per la ricerca di mutazioni associate con la patologia può essere perseguita nel DNA dei leucociti circolanti, sia in prelievi effettuati ante-mortem, ai fini della diagnosi «eziologica» di patologia.  Una ragionevole garanzia della totale eliminazione del potere «infettante» di «prioni» presenti in materiali contaminati si ottiene con un trattamento con NaOH IN per 60 minuti, seguito dal trattamento in autoclave a 121°C per 30 minuti.  Anche se, sperimentalmente, è possibile ottenere anticorpi monoclonali diretti contro epitopi «conformazionali» caratteristicamente esclusivi della isoforma patologica. La recente dimostrazione che è possibile «infettare» con proteine prioniche patologiche alcune sottopopolazioni di linee cellulari di origine nervosa centrale in coltura in vitro, con la produzione di elevati livelli, facilmente dimostrabili, di PrPSc, oltre che consentire un più agevole modello di indagine rispetto a quello offerto dall'infezione di animali da esperimento, potrebbe aprire la strada a tecniche diagnostiche di maggiore sensibilità e manegevolezza di quelle attualmente disponibili. Al momento non esistono terapie valide e non si ha notizia di guarigioni «spontanee» della patologia. Non esistono, ovviamente, efficaci strumenti di profilassi ed il rischio di trasmissione iatrogena (trasfusioni, trapianto di organi e tessuti) continuerà ad essere presente, per quanto estremamente modesto, sino a quando non saranno sviluppati test diagnostici efficaci e relativamente poco costosi per essere introdotti negli screening di routine dei donatori. Del resto, anche il rischio, pure se anch'esso relativamente modesto, della trasmissione della CJ- nv per via alimentare non è eliminato dai controlli effettuati sui bovini introdotti nella catena alimentare umana, i cui risultati sono essenziali per il monitoraggio dell'infezione animale, ma che, anche in caso di negatività, non garantiscono l'assoluta salubrità, sotto questo profilo, delle carni ammesse al consumo alimentare. Il recente sviluppo, grazie alle tecniche di ingegneria genetica, di bovini che mancano del gene che codifica la proteina prionica normale e che, quindi, dovrebbero essere esenti dalla relativa patologia, potrebbe rappresentare lo strumento in grado di garantire, anche se in una prospettiva temporale non molto prossima, la definitiva eliminazione delle patologie da prioni di origine alimentare.
 

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