I protoncogéni

cfr anche  P 53  

oncogenesi

Le cellule di un organismo multicellulare collaborano a vantaggio dell'intero organismo. Tuttavia, se una cellula ha una mutazione che le conferisce un vantaggio riproduttivo, sarà la fondatrice di un clone di numerose cellule che potranno prendere il controllo dell'organismo senza che ciò venga impedito dai meccanismi di controllo superiore che si sono evoluti a vantaggio dell'intero organismo. Il tumore è il risultato naturale di questa selezione fra cellule somatiche. Studi recenti hanno identificato tre gruppi di geni che risultano frequentemente mutati nelle neoplasie: gli oncogeni, i geni soppressori di tumori (TS), i geni mutatori. Gli oncogeni sono geni la cui azione promuove positivamente la proliferazione cellulare. Le versioni normalmente non mutate sono propriamente chiamate proto-oncogeni.

Le versioni mutate sono attive in modo eccessivo o improprio. Un singolo allele mutante può influenzare il fenotipo dell'intera cellula, cioè le mutazioni che si verificano sono dominanti. Questo implica che si abbia il segnale di proliferazione cellulare, promosso dagli oncogeni, anche in assenza di uno stimolo esterno (per esempio una ferita) o interno (trasmesso da un fattore di crescita). In altri casi il segnale di proliferazione cellulare si ha in presenza di un stimolo, però sono alterati i meccanismi di spegnimento del segnale.

Il gene C ret

Gene ret  (REarranged during Transfection) protoncogene. C-ret codifica per la sintesi del recettore per i fattori di crescita della famiglia GLIAL DERIVED NEUROTROPIC FACTORS. Questo recettore è presente in condizioni normali a livello nervoso. Esistono 3 diverse isoforme della proteina ret: ret 51, ret 43 e ret 9. Queste 3 isoforme si differenziano tra di loro per il numero di aminoacidi presenti nella coda aminoacidica terminale della proteina stessa. Tutte e 3 le isoforme proteine possono essere distinte in 3 principali domini:
- Un dominio extracellulare n terminale con 4 regioni simil caderina ed una regione ricca in cisteina
- Una regione idrofobica trans membrana

- Una regione citoplasmatica con un dominio catalitico tirosin-chinasico
 

Ruolo di  c-ret?

L'attivazione del recettore c-ret è caratterizzata dalla formazione di un complesso tra il ligando ed un corecettore GRF alfa (Growth factor receptor alfa). Il corecettore GRF alfa è importante perché nel momento in cui il ligando si lega al GRF alfa, 2 molecole di ret dimerizzano tra di loro  formando un ponte disolfuro. La dimerizzazione è data tra le due catene del recettore che attiverà la sua attività chinasica nei confronti delle proteine presenti all'interno della cellula facenti parte delle diverse vie di trasduzione del segnale. Perciò il complesso recettore-corecettore serve a favorire la dimerizzazione del recettore rec e la sua attivazione.
 

Trasformazione di c-ret in oncogene


Questa trasformazione avviene quando abbiamo una modificazione a livello cromosomico. A seguito di una inversione a livello cromosomico, avviene la rottura del gene in un punto, inversione di una piccola porzione del cromosoma ed il protoncongene c-ret si trova associato ad un altro gene con il quale prima  non aveva un rapporto di vicinanza.

A questo punto il gene ret si trova sotto il controllo del promoter di un altro gene, non obbedisce più al proprio promoter ma ad un altro promoter. Dunque si forma una sorta di gene di fusione. Il gene di fusione è formato da c-ret e da un altro gene con il quale c-ret viene a trovarsi vicino. Questo gene di fusione è diverso a seconda degli organi in cui avviene questo meccanismo di inversione.  Nel carcinoma papillare della tiroide (PTC ) per inversione sul cromosoma 10 vengono accostati 2 geni dapprima distanti (ret ed H4, ret e RFG-ret fused gene) con la formazione dei nuovi genui ret/ptc1 e ret/ptc2 che differiscono tra loro per il gene di fusione. Bisogna considerare che normalmente ret non viene espresso nelle cellule follicolari tiroidee, mentre è presente in tessuti di derivazione neuro ectodermica, nella midollare del surrene e nelle cellule parafollicolari della tiroide. Quindi ret prima non aveva un rapporto di vicinanza con H4 ed a seguito di questa inversione di cromosoma è come se si fosse spostato ed avvicinato ad un altro gene ed infatti ret si trova sotto il controllo del promoter di h4 che darà l'input per la trascrizione genetica. L'altra possibilità è che il gene ret formi un gene di fusione con il gene RFG formando il ret/ptc2. La proteine chimerica che ne deriva risulterà costitutivamente attivata in assenza di ligando. Il gene c ret viene ricercato in quelle famiglie in cui sono frequenti i tumori della tiroide. Mutazioni puntiformi di ret sono associate all'insorgenza del carcinoma della tiroide ed alla MEN (neoplasia endocrima multipla).  Esistono 2 forme di MEN, MEN2A e MEN2B per distinguere 2 diverse condizioni cliniche. Nel dominio extracellulare di ret, in condizioni normali, abbiamo l'aminoacido cisteina, presente in numero pari, cioè come se fosse presente in coppia. Nella forma MEN2A si ha la sostituzione di una cisteina. dapprima accoppiato con un'altra cisteina nel dominio extracellulare del recettore ret. La cisteina superstite reagisce con la cisteina di un altro recettore formando un nuovo dimero sempre attivo. Nella forma MEN2B abbiamo la sostituzione di una metionina con la treonina nel dominio extracellulare di ret, con attivazione costitutiva senza formazione del dimero. Quindi nel caso MEN2B dato che la sostituzione rigurada un aminoacido che non è presente in coppia, questo aminoacido sostituito con un altro determinerà questa attivazione del recettore indipendentemente dalla presenza del ligando e quindi questo recettore sarà sempre attivo. Chernobil: in seguito al disastro si è avuto una altissima frequenza di carcinomi papillari della tiroide nei bambini in Ucraina e Bielorussia con un'altissima frequenza di riarrangiamenti RET/ptc con prevalenza dell'isoforma ret/ptc3.
 

C-kit


Il protoncogene c-kit codifica per la sintesi del recettore per il fattore delle cellule stamal (stem cell factor o mast cell growth factor) con attività tirosin chinasica. Tale recettore si lega al fattore STF cioè al fattore stimolante le cellule staminali che agisce ancora più a monte nella maturazione dei tipi cellulari. E' ad attività chinasica e per essere attivato deve dimerizzare. Il recettore in realtà è presente in forma monomerica, forma inattiva che dimerizza dopo il legame con il ligando SCF che è una molecola dimerica che lega 2 recettori inattivi attivandoli. La porzione citoplasmatica si auto fosforila una volta che ha legato il fattore di crescita ed a sua volta fosforila tante proteine coinvolte nella trasduzione del segnale che attiva la trascrizione dei geni che attivano il ciclo cellulare. Le alterazioni genetiche di c-kit rendono il recettore sempre attivo, poiché dimerizza anche in assenza di ligando e tali alterazioni li troviamo in numerosi tumori gastrointestinali stromali. La trasformazione di c-kit in oncogene avviene a seguito della comparsa di mutazioni, responsabile dell'insorgenza di mastocitoma, tumori gastrointestinali stromali e tumori a cellule T.
 

Kinasi citoplasmatiche non recettoriali


Sono proteine citoplasmatiche costituite da molecole con proprietà tirosinchinasica e serin-treonin-chinasica, non associate a recettori, in grado di trasdurre il segnale extracellulare. Sono localizzare all'interno della membrana citoplasmatica dove ricevono segnali dall'esterno della cellula e lo trasmettono al livello del nucleo, attraverso la fosforilazione di target intracellulari in risposta a stimoli esterni promoventi la crescita. SRC è un protoncogene inizialmente studiato nei virus, l'omologo era VSRC. Inizialmente si è scoperto che VSRC era responsabile del sarcoma di Rous, tumore che colpiva i polletti che determinava iperproliferazione cellulare se infettati dal virus del sarcoma. Tale protoncogene ha un omologo anche nell'uomo. Non c'è molta differenza tra i vari tipi di proteina, nell'uomo, nel pollo o nel virus. Tutte e tre le proteine contengono 4 domini SRC Homology (SH) ed un unico diminio N-terminale con funzione sconosciuta. Il domini SH1 contiene un dominio con attività tirosin chinasica ed un residuo tirosinico conservato che interviene nell'autofosforilazione, mentre SH2 SH3 hanno funzioni regolatorie.  Normalmente SRC induce fosforilazione a livello citoplasmatico e queste fosforilazioni possono attivare oppure inibire le proteine. Se consideriamo il virus SRC il fatto che via una differenza strutturale serve a fare in modo che questa proteina sia costantemente attiva, quindi la trasduzione del segnale è sempre attiva e c'è sempre lo stimolo alla proliferazione cellulare. Le alterazioni vengono conferite al protoncogene da mutazioni o riarrangiamenti che possono essere delezioni o traslocazioni. Quindi il segnale sarà sempre attivo a prescindere che ci sia sempre il ligando.


C-ABL


Il protoncogene C-ABL è conivolto nella patogenesi della leucemia mieloide cronica. Il meccanismo è di attivazione del protoncogene ad oncogene è dato da traslocazione cromosomica  9-22. Infatti questo C-ABL è presente a livello di cromosoma 9 e viene spostato sul cromosoma 22 e più esattamente nelle lunghezze della regione BCR Breakpoint Cluster Region, BCR, che è una regione del cromosoma 22 particolarmente sensibile alle rotture cromosomiche. Quello che ne risulta è un nuovo cromosoma che presenta il materiale genico proveniente dal cromosoma 9 che prende il nome di cromosoma filadelfia, che presenterà un gene di fusione e quindi una proteina di fusione che ha sempre l'attività tirosinchinasica costitutiva per inviare il segnale di attivazione alle altre proteine che presentano attività chinasica. La fusione da questo gene ibrido costituito dall'estremità 5 della BCR e dall'estremità 3' di ABL. La traslocazione 9-22 che ritroviamo nella LMC ed anche in altre malattie mieloproliferative che sono cromosoma philaphelphia positive. Quindi questa proteina che invia segnali di fosforilazione consente alla cellula di dividersi indipendentemente da segnali esterni.

G-proteins


GTP binding proteins. Gruppo eterogeneo comprendente la famiglia di proteine codificate dai geni della famiglia RAS (H-ras, K -ras, N-ras) che hanno in comune la proprietà di legare il GTP e di essere accoppiati a recettori di membrana. Sono coinvolte nel trasferiment di segnali dall'esterno all'interno della cellula. Le G-proteins hanno maggiori affinità per il GTP che devono scindere in GDP: ciò è dovuto alla capacità di idrolizzare il GTP in GDP ed ad una maggiore affinità per il GTP piuttosto che per il GDP. Questo processo è regolato dalle proteine attivanti la GTPasi (GTPase activator proteins o GAPs) e dai Guanine Nucleotide excange factors o GEFS. Nello stato inattivo legano il GDP mentre quando sono stimolate da altri fattori di crescita sono attive. Ne momento in cui avviene la scissione di GTP grazie a GAPs ed avviene l'allontanamento del fosfato, Ras dovrebbe legarsi al GDP ma poiché abbiamo detto che ras ha una maggiore affinità per il GTP, allora ras deve tornare a legare il GDP legando un nuovo gruppo fosforico che gli viene offerto da un altro GTP e questo passaggio da GTP a GDP viene favorito dai GEFS. Il protoncogene che codifica per la sintesi di ras può subire mutazioni puntiformi per cui il protoncogene ras si trasformerà in oncogene. Ras mutato si lega a GAP, ma la sua attività di GTPasica viene persa e quindi RA mutato resta legato a GTO; in questa maniera è sempre attivo e manda segnali di fosforilazioni all'interno della cellula e quindi vengono ceduti continuamente gruppi fosforici senza che ci sia l'equilibrio per quanto riguarda il legame a GTP ed il legame a GDP. Indipendentemente dalla presenza del ligando e dall'attivazione del recettore, la proteina ras è costitutivamente attiva a causa del fatto che viene persa la sua attività GTPasica nel senso di trasformazione in GDP. Quali sono queste mutazioni che attivano il protoncogene in oncogene? Uno dei meccanismi è rappresentato dalle mutazioni puntiformi presenti a livello dei codoni 12-13 e 61.  Ras rappresenta uno dei geni che subiscono modificazioni già nelle prime fasi della carcinogenesi del colon. Ras modula l'attività cellulare mediante attivazioni di chinasi citoplasmatiche come le MAP chinasi e la proteina chinasi C, regolatore della proliferazione. La proteina K-ras controlla la proliferazione cellulare mediante attivazione di una via enzimatica.
 

Protoncogeni che codificano per i fattori di trascrizione nucleare.


I fattori di trascrizione nucleare sono le proteine che si legano a specifiche sequenza di DNA e regolano l'attività e l'espressione di altri geni, ricevono segnali che giungono dal citoplasma al nucleo ed infine convogliano tali segnali al DNA, promovendo oppure sopprimendo l'espressione di altri geni cellulari. Mutazioni a livelli di geni c-myc, c-jun e c-fos che codificano per i fattori di trascrizione nucleare sono associate a trasformazione maligna cellulare, poiché tali fattori regolano l'espressione del DNA legandosi a specifici siti del promoter di vari geni. Tali geni possono interferire con la regolazione della proliferazione cellulare facendo entrare le cellule continuamente nel ciclo mitotico.
 

c-myc


il protoncogene c-myc è l'omologo cellulare dell'oncogene virale v-myc. La sigla myc sta per avion myelocytomatosis virus. E' localizzato sul cromosoma 8q24 ed appartiene ad una famiglia di geni comprendente anche n-myc ed l-myc, nel linfoma di Burkit, una neoplasia che interessa i linfociti B per traslocazione cromosomica avviene lo spostamento del segmento del cromosoma 8 contenente c-my al cromosoma 14 q. La traslocazione porta il gene c-myc vicino agli elementi enhancers del gene che codifica per le catene pesanti dell'immunoglobuline. Cosi c-myc sarà sottoposto a stimolazione da parte di tali elementi. Gli enhancers sono attivi in maniera costituzionale nei linfociti. La versione oncogenica di c-myc è associata ad incrementata espressione costitutiva persistente della proteina con aumento della trascrizione di geni coinvolti nel controllo della progressione del ciclo e nella proliferazione cellulare. La proteina risulta dalla traduzione del secondo e terzo esone del protoncogene c-myc. Gli altri 2 geni della famiglia n-myc ed l-myc risultano amplificati ed iperespressi negli neuroblastomi e nei carcinoma polmonare a piccole cellule.


Oncosoppressori detti anche anti-oncogeni


Sono geni presenti ed espressi nelle cellule normali, sono geni regolatori negativi della crescita cellulare e di altre funzioni che possono essere correlate al potenziale invasivo e metastatico come l'adesione cellulare e la regolazione dell'attività protesica. La perdita della loro funzione ai associa alla comparsa del fenotipo tumorale. I geni oncosoppressori producono proteine che regolano l'attività mito genica. Tali geni sono anche definiti “gate keepers” GUARDIANI DEL CICLO CELLULARE, nel senso che evitano che ci siano mutazioni a carico del DNA e, quindi, se non funzionano la divisione cellulare diventa incontrollata, viene meno la differenziazione cellulare e quindi aumenta sempre più il potenziale maligno, in quanto agiscono come segnale di stop durante le fasi G1 (inibizione della crescita cellulare o G2 (progressione del ciclo). Condizione necessaria perché una mutazione non venga trasmessa alle cellule figlie è che una  cellula si blocchi prima di trasmettersi alle cellule figlie.

Meccanismo di inattivazione del gene oncosoppressore


L'inattivazione del gene oncosoppressore è funzione de:

- mutazioni puntiformi
- grosse delezioni ed inserzioni
- fenomeno che si chiama Loss over eterozigosi


Esso  è una caratteristica degli oncosoppressori e l'ipermetilazione del promoter del gene. Affinchè la cellula acquisisca il fenotipo neoplastico è necessario che la mutazione sia presente in duplice copia su tutte e due gli alleli, quindi si dice che la mutazione è presente in omozigosi e viene trasmessa in maniera recessiva mentre nel caso dei protoncogeni era necessario che ci fosse solo una mutazione in un solo allele. Se anche il secondo allele viene inattivato, la cellula perde il meccanismo di controllo negativo sulla proliferazione e va incontro a proliferazione di tipo neoplastico (oncosoppressore perde la sua funzione o loss of function) nel momento in cui subisce la trasformazione. La metilazione aberrante delle regioni CPG rappresenta un meccanismo alternativo per inattivare i geni oncosoppressori durante lo sviluppo del cancro. CPG indica la citosina e la guanina separate dal fosfato che lega i 2 nucleosidi nel DNA.
 

L'ipotesi di RANSON


Immaginiamo 2 alleli nornali in una cellula normale di un dato gene, supponiamo poi che un gene oncosoppressore subisca la mutazione su un solo allele, quindi un allele è mutato e l'altro no. A seguito di un altro evento genetico, il secondo allele può subire i un'altra mutazione puntiforme oppure una grossa perdita di materiale di delezione in una zona che coinvolge quell'allele. Se con la prima mutazione avevamo una condizione di eterozigosi, con la delezione del secondo allele avremo la perdita di eterozigosità.  I principali oncosoppressori sono BRCA che sta per breast cancer ed include BRCA1 e BRCA2 e poi P 53
 

BRCA


IL 78% sono sporadici, non ereditari mentre una piccola fetta comprende i tumori ereditari, nell'ambito di questi si è visto che una media del 5-6 % coinvolgono mutazioni di BRCA. Se l'ammalato è portatore di mutazione di uno di questi 2 geni, BRCA1 e BRCA2 allora si estende questo screening ad altri appartenenti alla famiglia. BRCA1 è localizzato sul cromosoma 17q1221, Ha 22 esoni e codifica per una proteina di 1863 aminoacidi che presenta vari domini strutturali e funzionali. La proteina è direttamente coinvolta nei processi di riparazione del DNA e nel mantenimento della stabilità genomica. Il gene mutato conferisce un rischio maggiore di insorgenza di tumori mammari ed ovarici. In condizioni normali BRCA1 ripara il danno a livello del DNA e si lega ad altre proteine espresse ad altri tipi di oncosoppressori come p53 per formare complessi proteici che intervengono nella riparazione del danno. BRCA1 e BRCA2 presentano vari domini, BRCA1 presenta un dominio RING FINGER che è  associato con la proteina BARD 1 che a sua volta attiva questo gene. Bard 1 è la proteina che si lega alla proteina di BRCA1 ed entra in gioco nei meccanismi di riparazione del DNA. La porzione centrale del gene BRCA1 interagisce con RAD 51 proteina coinvolta nella riparazione del DNA a doppia catena, quindi la proteina BRCA1 mediante BARD 1 e RAD 51 serve a riparare il danno del DNA a doppia catena.
 

Mutazioni più frequenti di BRCA1


Piccole inserzioni e delezioni ma anche la delezione di una base può indurre l'insorgenza del tumore e mutazioni non senso, cioè che portano alla formazione di codoni di stop UAA- AUG-UGA, per cui la proteina sarà tronca e ci sono delle regioni suscettibili a proteine tronche come accade nel caso dell'esone 11 e mutazioni che interferiscono con i siti di splicing con conseguente delezione parziale o completa di esoni ed inserzioni di sequenza introniche. La maggior parte delle mutazioni trovate nelle famiglie con cancri ovarici e mammari danno luogo alla formazione di proteine troncanti. Alcune mutazioni missenso che interessano i residui di cisteina di BRCA1 e ring domain sono presenti in famiglie ad alto rischio e sono considerate patogenetiche.  I migliori esempi si popolazioni con effetti fondatore sono rappresentati dagli ebrei Ashkenazy, sono famiglie ebree vissute confinati, quindi sono venuti a poco a poco a contatto con le persone esterne per motivi geografici e quindi in queste persone hanno circolato gli stessi geni: effetto fondatore.

 
BRCA2


E' localizzato sul cromosoma 13q12-13. Codifica per una proteina di 3418 aminoacidi. Gli esoni 11 e 10 comprendono almeno il 60% della sequenza codificante, La proteina è direttamente coinvolta nei processi di riparazione del DNA e nel mantenimento della stabilità genomica. Il gene mutato conferisce rischio di tumore mammario nella donna e nell'uomo ed in altri tipi di tumori come quello del pancreas. Quando compaiono queste mutazioni, compaiono anche in gioventù prima dei 40 anni .
 

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