Il processo riparativo

L'organismo umano è costantemente esposto a danni che possono provocare morte cellulare e distruzione tissutale. La riparazione del tessuto danneggiato è uno degli eventi più complessi che possono avvenire nel nostro organismo dopo la nascita. Diverse cellule residenti od infiltranti una ferita partecipano direttamente al processo di riparazione agendo da effettori dei fenomeni coagulativi, infiammatori ed immunitari che lo caratterizzano. Tali cellule possono andare incontro a fenomeni migratori, proliferativi, apoptotici e/o differenziativi producendo diverse molecole strutturali e regolatorie. L'azione coordinata nel tempo di numerose citochine, chemochine, fattori di crescita, componenti della matrice extracellulare, proteasi e corrispondenti recettori rappresenta infatti un presupposto fondamentale per il corretto svolgimento del processo riparativo e, dove possibile, per il ripristino funzionale del tessuto leso. La maggior parte delle molecole solubili agisce su brevi distanze, legando ed attivando recettori presenti sulle stesse cellule produttrici attraverso un meccanismo autocrino o su cellule .adiacenti di diverso tipo attraverso un meccanismo paacrino. Inoltre, la matrice extracellulare gioca un ruolo fondamentale nel "cross talk" tra le diverse cellule che partecipano alla riparazione della ferita, sia legando citochine e fattori di crescita (regolandone quindi la bio-disponibilità, interazione cellulare ed attività biologica), sia ingaggiando direttamente specifici recettori cellulari a molteplice significato biologico.

Svariati agenti eziologici chimici, fisici o biologici possono causare lesioni tessutali con meccanismi eterogenei dipendenti dalla natura dell'agente stesso (azione diretta). Tale eterogeneità viene però controbilanciata dal fatto che l'agente eziologico, in maniera relativamente indipendente dalla sua natura, scatena l'attivazione di meccanismi a finalità difensiva che contribuiscono in modo significativo al danno tessutale (azione indiretta). In effetti, fenomeni quali la coagulazione, l'essudazione e la risposta immunitaria possono amplificare il fenomeno lesivo se attivati in modo abnorme. Il processo riparativo è modulato in relazione alla gravità/estensione del danno. Ad un agente lesivo di blanda intensità che provoca solo una limitata risposta infiammatoria (come nel caso di ustioni di primo grado) segue il fenomeno di risoluzione, consistente nel riassorbimento dell'essudato da parte del circolo linfatico e nel ripristino delle condizioni emodinamiche precedenti il danno. Diversamente, un agente eziologico aggressivo e/o persistente può provocare una perdita netta di tessuto biologico in seguito a danno diretto o a fenomeni necrotici conseguenti al protrarsi del processo infiammatorio. In questo caso verranno innescati i meccanismi responsabili del processo di guarigione. Due distinti fenomeni partecipano al processo di guarigione: la rigenerazione e la reintegrazione connettivale. La prima può essere intesa come il ripristino delle cellule funzionali del tessuto danneggiato. La seconda consiste invece nella sostituzione delle cellule funzionali danneggiate con tessuto connettivo. Il grado di recupero funzionale (restitutio ad integrum) del tessuto leso dipende pertanto dal rapporto rigenerazione/reintegrazione connettivale che, a sua volta, dipende dall'entità del danno e dal potenziale rigenerativo delle cellule danneggiate. In linea generale, danni molto estesi con perdita dell'architettura stromale non possono essere riparati solo per rigenerazione neanche in tessuti costituiti da cellule con elevato potenziale rigenerativo. Quindi, il processo riparativo si accompagna quasi sempre ad un certe grado di reintegrazione connettivale e perdita di funzionalità (fibrosi). La riparazione tissutale viene attivata in svariate patologie che coinvolgono tessuti diversi ed il suo corretto svolgimento è alla base del successo degli interventi chirurgici e dei trapianti. L'estrema eterogeneità dei meccanismi di tale processo introduce un importante concetto: l'andamento e le conseguenze del processo riparativo non dipendono solo dall'estensione della lesione ma anche dai tipi cellulari che compongono tessuti danneggiati. In effetti, per ogni tipo di lesione è possibile identificare uno specifico tipo cellulare particolarmente coinvolto nel processo riparativo, pur senza dimenticare che esistono cellule ubiquitarie nei nostri tessuti (fibroblasti, cellule endoteliali ed altre che intervengono costantemente nei fenomen coagulativi e infiammatori che caratterizzano le prime fasi della riparazione del danno (piastrine, leucociti, linfociti).

Ne consegue la possibilità di identificare alcuni fenomeni (quali coagulazione, infiammazione ed immunità) che caratterizzano il processo riparativo indipendentemente dal tessuto in cui esso avviene. Il corretto svolgimento di tali fenomeni è un prerequisite fondamentale per il successo del processo riparativo. Ad esempio, la corretta rimozione del coagulo, così come la quantità, composizione, persistenza e riassorbimento dell'essudato, giocano un ruolo importante nel determinare gli esiti della riparazione. D'altra parte, un'attivazione abnorme della risposta immunitaria c la sua mancata terminazione possono compromettere il processo riparativo. Coagulazione, infiammazione e immunità sono regolate da diversi tipi cellulari ai quali deve essere facilitato l'accesso alla ferita ed assicurato un adeguai apporto trofico. Ciò viene garantito dalla formazione di una nuova rete microvascolare che va ad irrorare la ferita (neovascolarizzazione o angiogenesi). Un'inadeguata neovascolarizzazione può quindi compromettere il processo riparativo. Durante tale fenomeno si possono distinguere diversi processi, alcuni più veloci, altri estremamente lenti, che avvengono sequenzialmente o contemporaneamente ma sempre in stretta coordinazione. La presenza, durata e contributo delle singole fasi al processo riparativo dipendono dall'estensione della ferita e quindi dalla quantità di tessuto da riparare) e dalla  eventuale infezione microbica (e quindi dalla presenza di microrganismi/detriti necrotici da eliminare).

Il processo di riparazione

La guarigione di una ferita dermo-epidermica non infetta a margini giustapposti, quale una incisione chirurgica asettica, avviene per prima intenzione.  Entro pochi minuti, lo spazio tra i margini della ferita si riempie di sangue coagulato contenente fibrina e fibronectina. La parte più superficiale del coagulo si disidrata formando la crosta (escara) che previene l'eccessiva disidratazione e possibili infezioni microbiche. Più profondamente, la trama di fibrina e fibronectina agisce da "collante" mantenendo ravvicinati i margini della ferita e servendo da "traccia" per la migrazione delle cellule infiltranti.

Entro poche ore si osserva l'attivazione dei cheratinociti sopravvissuti ai bordi della ferita.- Tali cellule si muovono sulla trama di fibrina/fibronectina alla velocità di 0,5 mm al giorno. Le cellule al fronte di migrazione assumono capacità fagocitaria, facendosi così strada al di sotto dell'escara. La sola migrazione dei cheratinociti può assicurare la copertura di ferite limitate mentre, nella maggior parte dei casi, la completa rigenerazione cutanea richiede anche la proliferazione dei cheratinociti stessi. Questa avviene principalmente a carico delle cellule dello strato basale dell'epidermide, stimolate sia dalla perdita dell'inibizione da contatto sia dalle diverse citochine rilasciate durante la lesione. Entro 24-48 ore la rigenerazione epiteliale è completa, avendo prodotto un sottile strato epiteliale non cheratinizzato che rimargina i lembi della ferita. Contemporaneamente il coagulo sottostante viene invaso da leucociti (prima neutrofili e poi macrofagi) che si dirigono verso il letto della ferita muovendosi nella trama di fibrina/fibronectina secondo gradienti chemiotattici. Una volta in situ, i leucociti procedono alla digestione controllata del coagulo attraverso il rilascio di enzimi litici. A partire dal terzo giorno inizia il processo di neo-vascolarizzazione. Le cellule endoteliali dei capillari ai margini della lesione vengono stimolate a proliferare e migrare verso il letto della ferita. Le cellule endoteliali al fronte di migrazione secernono proteasi che, digerendo il coagulo, permettono l'avanzamento delle cellule stesse. Si formano così degli "abbozzi" vasali solidi che progrediscono all'interno della ferita con una velocità compresa tra 0,1 e 0,8 mm al giorno. Dalla confluenza di diversi gettoni endoteliali rigenererà, dopo opportuno rimodellamento con formazione del lume vascolare, una nuova rete di capillari azionali. Diversi fattori angiogenetici partecipano i tale processo. Essi sono principalmente prodotti dai leucociti infiltranti, a loro volta stimolati dall'ipossia che si instaura all'interno del coagulo. A livello funzionale, la formazione di una nuova rete capillare facilita il continuo apporto di cellule e di fattori trofici necessari per sostenere l'elevata attività metabolica che caratterizza la ferita a questo stadio. A livello morfologico, la vascolarizzazione della ferita determina il suo aspetto rosato e granulare che gli fa guadagnare la definizione di tessuto di granulazione. Infine, già questa fase si osserva la proliferazione di fibroblasti e deposizione di collagene (principalmente di tipo III) margini della ferita. Entro una settimana lo spessore e la cheratinizzazione dello strato epidermico saranno aumentati mentre alla a base inizierà la deposizione di una nuova, ma ancora continua, membrana basale. Più profondamente, il tessuto di granulazione avrà quasi completamente sostituito il coagulo. I fibroblasti raggiungono il loro picco proliterativo e cominciano a depositare proteoglicani e collagene di tipo I (che si dispone ad unire i margini della ferita in sostituzione del collagene di tipo III). Inizia la rigenerazione dei vasi linfatici e la renervazione. Dalla seconda settimana, parallelamente alla completa maturazione dell'epidermide e della membrana rasale, si osservano la regressione della rete vascolare a progressiva scomparsa dell'infiltrato leucocitario fibroblastico. La perdita della componente cellulare, che col progredire del processo di guarigione esaurisce il suo compito e quindi la sua ragione d'essere, avviene principalmente per apoptosi. Continua invece la depone di collagene di tipo I che gradualmente sostituisce il collagene di tipo III fino a ristabilire il normale rapporto quantitativo di 5 a 1 tra le due componenti. Alla fine del primo mese il tessuto cicatriziale è denaturo, cioè costituito quasi esclusivamente da tessuto connettivo acellulare ricoperto dall'epidermide con ,-Jita irrimediabile degli annessi cutanei. Nei mesi successivi il processo di maturazione della matrice continua con la formazione di legami stabili e fibrille di collagene. La cicatrice pertanto raggiunge il massimo grado di resistenza alla tensione, rz rimarrà comunque inferiore del 20-30% rispetto a quella della cute intatta. A volte alcuni dei processi che caratterizzano la riparazione di una ferita dermoepidermica non vengono .ceguatamente controllati, dando origine a guarigioni arnormi. Ad esempio, una riepitelizzazione incontrollata  può causare l'eccessiva proliferazione dei cheratinociti, portando alla formazione di cisti epidermoidi. Analogamente, una deposizione incontrollata di collagene può dare origine ad una cicatrice ipertrofica che, nei casi più gravi, può evolvere nei cosiddetti cheloidi (cicatrici deturpanti che "invadono" il tessuto circostante la ferita). Diversi fattori predispongono alla formazione dei cheloidi: gli individui di razza nera sono più soggetti a questo rischio, ma anche il tipo di danno e la sua estensione sono importanti. Ad esempio la formazione di cheloidi è più frequente in seguito a gravi ustioni. A livello molecolare, squilibri nella produzione di alcune citochine (vedi oltre) svolgono un ruolo fondamentale nella formazione dei cheloidi. Il processo di guarigione può essere rallentato da numerose situazioni che si possono creare sia a livello locale sia sistemico. L'ampia estensione dell'area lesa, una sua eventuale infezione e la presenza di corpi estranei interferiscono con il processo riparativo e sono comunemente riscontrabili in ferite lacero-contuse estese da trauma. D'altra parte, l'eccessiva mobilità della zona lesa od un ridotto grado di vascolarizzazione/ossigenazione rappresentano situazioni a forte impatto negativo durante la guarigione. La vascolarizzazione di una ferita può essere compromessa da patologie quali l'aterosclerosi, fenomeni trombotici venosi, ed il diabete mellito scompensato. Diverse collagenopatie (quali la sindrome di Ehlers-Danlos e l'epidermolisi bollosa), episodi di malnutrizione (quali l'avitaminosi C, meglio nota come scorbuto) e le ipoproteinemie rallentano il processo riparativo principalmente alterando quantitativamente o qualitativamente la deposizione di collagene. Comunque, tra le varie situazioni che interferiscono con il processo riparativo, quella sicuramente più frequente è una significativa perdita di tessuto e/o necrosi indotta da infezioni secondarie. Queste condizioni rappresentano ostacoli che si frappongono alla guarigione che avverrà in questo caso per seconda intenzione. La maggior quantità di coagulo, i detriti necrotici ed eventuali batteri da eliminare intensificano il fenomeno infiammatorio che, a sua volta, amplifica il processo di neovascolarizzazione, prolungando significativamente le fasi iniziali della guarigione. Da quanto finora descritto risulta chiaro che i processi di guarigione per prima o per seconda intenzione sono mediati dagli stessi meccanismi, che agiscono però con differente intensità e durata. Ciò che invece distingue nettamente i due tipi di guarigione è il fenomeno della contrazione della ferita, che si manifesta solo nelle glandi ferite cutanee che guariscono per seconda intenzione. La contrazione della ferita avviene principalmente ad opera dei miofibroblasti, cellule derivate dal differenziamento di fibroblasti e che assumono caratteristiche strutturali e funzionali proprie delle cellule muscolari lisce tra cui la presenza di microfilamenti composti da actina, miosina e dalla isoforma di alfa-actina delle cellule muscolari lisce (alfa-SMA). In animali da laboratorio, la contrazione può determinare una riduzione fino al 10% dell'area della ferita, rendendo più veloce il processo di rigenerazione/reintegrazione e quindi la guarigione stessa. A tale proposito, la terapia a pressione negativa rappresenta una promettente opzione terapeutica per stimolare il processo di guarigione di ferite di varia eziologia, sia di natura acuta (traumatiche, ustioni, esiti post-chirurgici) sia di natura cronica (ferite da pressione, ulcere vascolari). Essa consiste nell'applicazione di una pressione sub-atmosferica controllata sul letto della ferita che causa principalmente la retrazione della ferita stessa ma anche un aumento della velocità di formazione del tessuto di granulazione. L'applicazione della pressione negativa esercita inoltre una continua pulizia della ferita che riduce il carico batterico e l'edema tessutale, favorendo una migliore irrorazione sanguigna dell'area lesa. Diverse cellule partecipano alla riparazione delle ferite dermo-epidermiche. Le piastrine, coinvolte principalmente nel processo coagulativo, sono le prime ad essere attivate, seguite quindi dai neutrofili e macrofagi implicati nella rimozione del coagulo e dei detriti necrotici. Parallelamente, entrambi questi tipi cellulari elaborano e rilasciano diverse molecole ad azione regolatoria che, agendo sulle stesse cellule produttrici (stimolazione autocrina) o su cellule bersaglio quali le cellule epiteliali, endoteliali e fibroblasti (stimolazione paracrina) innescano e regolano l'andamento dell'infiammazione, riepitelizzazione, neovascolarizzazione e cicatrizzazione. A loro volta attivate, le cellule epiteliali, endoteliali ed i fibroblasti sintetizzano molecole ad azione regolatoria con ampio spettro d'azione. Si genera così un'intricata rete di regolazioni intercellulare che rappresenta il presupposto fondamentale per un corretto svolgimento del processo riparativo.

Basi molecolari della riparazione delle ferite dermoepidermiche

Le molecole ad azione regolatoria che intervengono nel corso delle prime ore dopo il danno sono le stesa che caratterizzano le prime fasi del processo infiammatorio (istamina, leucotrieni, prostaglandine). In poche ore però l'importanza di questi mediatori diminuisce diventando preponderante il ruolo delle citochine e de: fattori di crescita neosintetizzati dalle cellule attivi nel corso del processo riparativo. Parallelamente, sulla superficie di tali cellule vengono espressi i recettori corrispondenti nonché recettori per componenti della matrice extracellulare.

I mediatori solubili

Il "platelet-derived growth factor" (PDGF) è una citochina eterodimerica contenuta nei granuli alfa delle piastrine dai quali viene rapidamente rilasciata dopo attivazione. Nel corso delle fasi più tardive del processo di riparazione, il PDGF continua ad essere prodotto dai macrofagi e dalle cellule endoteliali. Una volta secreto, il PDGF lega due diversi recettori (PDGFR-alfa e PDG-FR-beta) presenti sulla superficie delle cellule bersaglio, svolgendo un duplice ruolo nel processo di riparazione delle ferite: un precoce richiamo chemiotattico delle cellule dell'infiammazione e dei fibroblasti, ed una tardiva stimolazione della proliferazione dei fibroblasti e del loro differenziamento in miofibroblasti. Al contrario, il PDGF non sembra essere implicato nel processo di vascolarizzazione e di formazione del tessuto di granulazione. Il PDGF è stato il primo fattore di crescita utilizzato per il trattamento clinico delle ulcere.
La famiglia degli "epidermal growth factors" EGFs) comprende numerosi membri, tra cui l'EGF stesso ed il "transforming growth factor-alfa" (TGF-alfa). che esercitano la loro azione biologica legando quattro diversi recettori (EGFR/erBs). La concentrazione di questi fattori di crescita aumenta significativamente nella ferita dermo-epidermica. In particolare, la ro produzione da parte dei cheratinociti proliferanti gerisce un meccanismo d'azione autocrino nel processo di riepitelizzazione, confermato dall'aumentata essione dei recettori EGFR/erBs sulla superficie rei cheratinociti stessi. TGF-a ed EGF possono inoltre essere prodotti da macrofagi e da fibroblasti, inducensione la proliferazione. Il TGF-beta è una proteina omodimerica che fa parte della famiglia dei "transforming growth factors". Immediatamente dopo il danno, il TGF-beta rilasciato dalle mastrice agisce da fattore chemiotattico per neutrofili, m.acrofagi e fibroblasti. Tali cellule contribuiscono a loro volta alla produzione di TGF-beta nella ferita, mantenendone elevati i livelli nel corso del processo di riparazione. Il ruolo svolto dal TGF-beta in tale processo è dunque controverso. Studi in vivo hanno dimostrato che la sua espressione favorisce la riepitelizzazione, angiogenesi e cicatrizzazione. Studi in vitro hanno invece dimostrato che il TGF-beta può stimolare o inibire la proliferazione di cheratinociti e fibroblasti a seconda dalla sua concentrazione e dalla presenza di altri fattori di crescita. E' plausibile che il TGF-beta, piuttosto che regolare direttamente la proliferazione dei cheratinociti, cellule endoteliali e fibroblasti, moduli in queste cellule e l'espressione di diversi recettori e quindi la loro capacità di rispondere ad altre citochine e componenti della matrice extracellulare. Il TGF-beta è inoltre implicato nel differenziamento dei miofibroblasti e nella sintesi e deposizione di collagene. Una sua abnorme attività contribuisce alla formazione dei cheloidi.  L'"hepatocyte growth factor/scatter factor" (HGF/SF) è prodotto da diverse cellule mesenchima-i ed agisce legando un recettore tirosino-chinasico nominato MET espresso su cellule epiteliali ed endoteliali. L'HGF/SF induce dissociazione ("scatter"), migrazione, produzione di proteasi e proliferazione dei cheratinociti. Tali caratteristiche sembrerebbero indicare un ruolo di HGF/SF nelle prime fasi del processo di epitelizzazione durante le quali i cheratinociti intatti riargini della lesione devono dissociarsi e migrare T colonizzare l'area denudata della ferita. L'HGF/ SF è anche in grado di indurre migrazione, produzione proteasi e proliferazione in cellule endoteliali stimolando l'angiogenesi e la formazione del tessuto di granulazione in modelli sperimentali di lesioni dermo-epidermiche.
La famiglia dei "fibroblast growth factors (FGFs) comprende 23 membri strutturalmente e funzionalmente correlati e che esercitano i loro effetti biologici legando quattro diversi recettori tirosinochi-nasici (FGFRs). La maggior parte degli FGFs è caratterizzata dalla capacità di indurre la proliferazione di un largo spettro di tipi cellulari (compresi fibroblasti e cellule endoteliali). Numerose sono le evidenze che suggeriscono un ruolo importante degli FGFs nel processo di riparazione delle ferite. Come già osservato per il TGF-a, l'espressione degli FGFs è enormemente aumentata nei cheratinociti dopo lesione epidermica, suggerendone un ruolo autocrino nel processo di riepitelizzazione. Gli FGFs possono essere prodotti in grande quantità e varietà anche da leucociti, linfociti, fibroblasti e cellule endoteliali infiltranti la ferita. Il picco massimo di concentrazione viene raggiunto durante la formazione del tessuto di granulazione, contribuendo al processo di vascolarizzazione. In effetti, gli FGFs, ed in particolare TFGF2, esercitano una forte attività angiogenetica in vivo. Infine gli FGFs potrebbero essere coinvolti nelle fasi di maturazione del tessuto cicatriziale, come sug¬gerito dalla diminuita deposizione di collagene riscontrata in lesioni dermo-epidermiche indotte in topi ge¬neticamente modificati incapaci di sintetizzare FGF2.
La famiglia dei "vascular endothelial growth factors" (VEGFs) comprende 6 membri [VEGF-A, -B, -C, -D, -E ed il "placental growth factor" (PLGF)] che legano con diversa specificità tre recettori, tirosino-chinasici (VEGFR1, 2, 3). VEGF-A è una proteina omodimerica di cui esistono diverse isoforme generate per splicing alternativo dello stesso trascritto genico. L'ipossia che si viene a creare in una ferita dermo-epidermica e diverse citochine (tra cui TGF-beta, PDGF, ed IL-1) stimolano la produzione di VEGF-A da parte dei macrofagi e dei cheratinociti. I VEGFs interagiscono con i recettori VEGFR1 e 2 espressi dalle cellule endoteliali e rappresentano i principali regolatori dell'angiogenesi durante la formazione del tessuto di granulazione. I VEGFs sono inoltre in grado di aumentare la permeabilità capillare, favorendo quindi la diapedesi leucocitaria e promovendo l'apporto trofico a livello della ferita.
Di particolare importanza durante l'angiogenesi è l'interazione del VEGF-A con il recettore VEGFR2. Come per altri recettori tirosino-chinasici, il legame di VEGF-A alla regione extracellulare di VEGFR2 causa la dimerizzazione del recettore e l'attivazione della sua porzione citoplasmatica ad attività tirosino-chinasica. Nel dimero, ciascun recettore fosforilerà la controparte, determinando la fosforilazione di numerosi residui di tirosina appartenenti alle code citoplasmatiche di entrambi i recettori. I residui di fosfotirosina diventano quindi siti per il legame diretto o indiretto di molecole dotate di domini di tipo SH2 ("Src homology 2") coinvolte nella trasduzione del segnale intracellulare
Tra i segnali di trasduzione attivati dall'interazione VEGF-A/VEGFR2 ricordiamo:
a) l'attivazione della fosfoinositide 3-chinasi (PI3K) e della "focal adhesion kinase" (FAK) con conseguente riorganizzazione del citoscheletro e delle placche focali di adesione che favoriscono la migrazione endoteliale;
b) l'attivazione della chinasi citoplasmatica Akt, sempre conseguente all'attivazione di PI3K, che favorisce la sopravvivenza delle cellule endoteliali inibendo i segnali di morte apoptotica mediati da Bad e dalla caspasi 9;
c) l'attivazione di Akt induce inoltre aumento di per¬meabilità vascolare mediante la produzione di ossido nitrico (NO) conseguente all'attivazione dell'enzima NO sintasi inducibile;
d) l'attivazione della via delle "mitogen-activated pro-tein kinases" (MAPKs) con conseguente stimola¬zione della proliferazione cellulare;
e) l'attivazione della fosfolipasi C-y (PLC-y) che porta alla produzione della prostaciclina PGI2.
Infine, ricordiamo il ruolo svolto nella proliferazione dell'endotelio linfatico da parte di VEGF-C e VEGF-D che interagiscono con tale endotelio mediante il recettore VEGFR3.
Un altro gruppo di citochine specifiche per l'endotelio sono le angiopoietine il cui recettore Tie2 è espresso dalle cellule endoteliali. A differenza dei VEGFs, le angiopoietine non inducono proliferazione delle cellule endoteliali bensì regolano la maturazione ed il rimodellamento dei capillari neoformati modulandone l'interazione con i periciti.


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